非小细胞肺癌组织中Napsin-A表达与EGFR基因的相关性研究

韩志刚, 俞婷婷, 申红丽, 阿力木江·赛提瓦尔地

(新疆医科大学附属肿瘤医院 肺内一科, 新疆 乌鲁木齐, 830011)

作为一个极有潜力的肺腺癌诊断标志物，Napsin-A是天门冬氨酸蛋白酶家族中的新成员，可在异常增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞、原发性肺腺癌和极少部分大细胞癌中表达[1-2]。表皮生长因子受体(EGFR)具有酪氨酸激酶活性，为原癌基因e-erbB-1的表达产物。研究[3]表明，EGFR在非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、大肠癌及乳腺癌组织中均过度表达。本研究通过分析NSCLC组织中Napsin-A表达与EGFR基因的关系，来探讨Napsin-A在肿瘤形成过程中的作用，以期为NSCLC的临床诊断、治疗及预后评估提供帮助，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年6—12月本院收治的经病理确诊并取得组织标本的NSCLC 89例，其中腺癌53例，鳞癌36例。所有患者的血红蛋白、肝肾功能和心电图检查均正常，既往均未接受过放疗、化疗，无其他恶性肿瘤病史及心脑血管疾病。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂：兔抗人Napsin-A多克隆抗体、SABC试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组织化学检测：全部组织标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，连续4张, 60 ℃恒温箱中烘烤20 min, 脱蜡水化。采用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，进行抗原修复，滴加一抗, 4 ℃冰箱过夜；滴加二抗，冲洗后DAB染色；苏木素复染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，试剂生产公司提供的切片作为阳性对照。

1.2.3 EGFR基因检测：将提取的DNA稀释成2 ng/μL, 取出阳性质控品和Taq酶(EGFR29), 阳性质控品先解冻，再振荡混匀，两者快速离心15 s待用；分别向45 μL待测样品DNA、5 μL阳性质控品(STD)和45 μL超纯水中加入2.25 μL Taq酶(EGFR29)，涡旋器上混匀15 s后再快速离心15 s; 在PCR管冰架上轻轻揭开8联PCR管反应条条盖，将混好的DNA和Taq酶样品依次取5 μL加入8管中，然后小心盖上条盖；离心8连管反应条，将其放入荧光实时PCR仪(StatageneMX3000PTM)。

设置PCR参数第一阶段: 95 ℃ 5 min, 1个循环；第二阶段: 95 ℃ 25 s, 64 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 15个循环；第三阶段: 93 ℃ 25 s, 60 ℃ 35 s, 72 ℃ 20 s, 15个循环，信号收集。第三阶段60 ℃收集FAM和HEX信号。保存文件，执行实时PCR，约90 min完成检测。

1.3 评价标准

采用盲法，由2位病理科主治医生于光镜下分别对Napsin-A结果进行评定。若有意见分歧，则由2位医生共同阅片决定。Napsin-A主要表达于肿瘤细胞质，以细胞质和(或)细胞膜呈棕色颗粒状染色为标准，观察5个视野(×200)，分别计数100个细胞，以阳性细胞<5%为阴性，≥5%为阳性。

2 结果

2.1 Napsin-A在NSCLC组织中的表达

免疫组化染色结果显示，Napsin-A在NSCLC组织中主要表达于肿瘤细胞，阳性着色位于细胞质，呈棕黄色、颗粒状及弥漫性分布；在腺癌和鳞癌组织中的阳性率分别为96.2%(51/53)和5.6%(2/36), 两者比较差异有统计学意义(P=0.000)。见图1、2。

图1 Napsin-A在腺癌组织中的表达 100倍

图2 Napsin-A在鳞癌组织中的表达 100倍

2.2 Napsin-A表达与NSCLC临床病理特征的关系

Napsin-A在NSCLC不同临床分期、组织分化程度及有无淋巴结转移中的表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 Napsin-A在NSCLC组织中的表达及其与EGFR的关系

腺癌组织中, EGFR基因突变率为54.7%(29/53), 而Napsin-A表达阳性者的突变率高达100%; 鳞癌组织中, EGFR基因突变率为5.6%, 而Napsin-A表达阳性者的突变率为50.0%。两者Napsin-A表达阳性者突变率比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 Napsin-A表达与NSCLC临床病理的关系[n(%)]

表2 Napsin-A在NSCLC组织中的表达及其与EGFR的关系[n(%)]

3 讨 论

中国居民死因调查结果显示，近20年来，肺癌死亡率增加了近1.5倍，是增长最快的恶性肿瘤[4]。肺腺癌是最常见的肺癌组织学类型，发病率呈上升趋势。研究[5]表明，Napsin-A可能是提示肺腺癌患者预后较好的标记物。Napsin-A对原发性肺腺癌具有极高的特异性，即高分化腺癌表达最强，中分化腺癌表达较弱，低分化腺癌表达最弱[6]。易瑞沙和特罗凯是近年来开发的2种特异性较高的治疗NSCLC的肿瘤靶向治疗药物，能通过抑制肿瘤发生、发展中必需的EGFR络氨酸激酶活性而阻断肿瘤细胞的信号传导，从而抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移和血管生成，促进肿瘤细胞凋亡。但两者疗效存在很大个体差异，仅有25%～35%患者能取得很好的疗效[7]。研究[8]发现，EGFR基因络氨酸激酶区域存在多种突变，其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子L858R最为常见，这些突变能很好地预测易瑞沙和特罗凯的治疗效果，为肿瘤用药提供指导依据。但EGFR基因检测费用较高，在新疆多数医保不能报销，且新疆地处边远，经济欠发达，许多患者因经费困难拒绝行基因检测，这就在一定程度上限制了靶向药物的使用，使多数患者错失了靶向药物治疗的最佳时机。本研究结果显示，Napsin-A在腺癌和鳞癌组织中的阳性率分别为96.2%和5.6%, 可见Napsin-A在肺腺癌组织中的表达率较高。腺癌组织中EGFR基因突变率为54.7%，而鳞癌组织中仅为5.6%, 说明腺癌组织中EGFR基因突变率也相对较高。无论在腺癌还是鳞癌组织中，Napsin-A表达阳性者EGFR基因突变率均较高，但腺癌组织明显高于鳞癌组织。

[1] Yamashita Y, Nagasaka T, Naiki-Ito A, et al. Napsin A is a specific marker for ovarian clear cell adenocarcinoma[J]. Mod Pathol, 2014, [Epub ahead of print].

[2] Aulakh K S, Chisholm C D, Smith D A, et al. TTF-1 and napsin A do not differentiate metastatic lung adenocarcinomas from primary esophageal adenocarcinomas: proposal of a novel staining panel[J]. Arch Pathol Lab Med, 2013, 137(8): 1094.

[3] Oh M J, Choi J H, Kim I H, et al. Detection of epidermal growth f actor receptor in the serum of patients with cervical carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(12): 4760.

[4] 李连弟, 鲁凤珠, 张思维, 等. 中国恶性肿瘤死亡率20年变化趋势和近期预测分析[J]. 中华肿瘤杂志, 1997, 19(1): 3.

[5] Turner B M, Cagle P T, Sainz I M, et al. Napsin A, a new marker for lung adenocarcinoma, is complementary and more sensitive and specific than thyroid transcription factor 1 in the differential diagnosis of primary pulmonary carcinoma: evaluation of 1674 cases by tissue microarray[J]. Arch Pathol Lab Med, 2012, 136(2): 163.

[6] Schauer-Vukasinovic V, Langen H, Giller T. Detection of immunoreactive napsin A in human urine[J]. Biochim Biophys Acta, 2001, 1524(1): 51.

[7] Lim S H, Lee J Y, Sun J M, et al. Comparison of clinical outcomes following gefitinib and erlotinib treatment in non-small-cell lung cancer patients harboring an epidermal growth factor receptor mutation in either exon 19 or 21[J]. J Thorac Oncol, 2014, 9(4): 506.

[8] Hwang K E, Kwon S J, Kim Y S, et al. Effect of simvastatin on the resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors in a non-small cell lung cancer with the T790M mutation of EGFR[J]. Exp Cell Res, 2014, 323(2): 288.