脑线粒体形态和呼吸链参与D-半乳糖诱导脑衰老的研究

雷 鸣, 朱祖健

(江苏建康职业学院解剖学教研室, 江苏 南京, 210029)

长期大剂量注射D-半乳糖由氧化应激诱导脑衰老的动物模型，是国内较公认的研究，但其具体机制尚不明确[1]。研究[2]表明，很多因素参与了D-半乳糖诱导脑衰老的过程，包括钙稳态、钠钾ATP酶活性[3]和胆碱能神经系统[4]等，但对线粒体，尤其是脑线粒体形态和功能的详细研究较少。线粒体是细胞能量代谢中心，脑线粒体的结构和功能对于维持神经元的正常功能起着重要作用。研究表明，脑衰老的发生发展过程脑线粒体的形态和功能均出现异常[5]。线粒体呼吸链是细胞内活性氧(ROS)生成的主要部位，同时也是ROS损伤作用的靶器官。线粒体呼吸链功能损伤又会在ATP合成过程中产生更多的ROS, 此恶性循环加剧了衰老及其相关的神经退行性疾病的进程[6]。因此，脑线粒体功能障碍可能是此动物模型的发病机制之一。本实验选择D-半乳糖制备动物模型，通过检测脑线粒体呼吸链复合物的活性，以及电镜观察海马线粒体超微结构的改变，以探讨脑线粒体的形态和功能在D-半乳糖诱导脑衰老中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

动物分组及模型制作：健康的雄性C57BL/6小鼠20只(南京医科大学动物中心提供)，体质量26～28 g。动物随机分为2组: ① D-半乳糖注射组，小鼠10只，按文献[4]方法造模复制小鼠衰老模型，腹腔注射D-半乳糖100 mg/(kg·d), 持续6周; ② 对照组，小鼠10只，腹腔注射等量生理盐水，持续6周。D-半乳糖购于武汉博士德公司，线粒体呼吸链复合物活性定量检测试剂盒由南京建成生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 脑线粒体提取：小鼠断头处死，快速取脑，制备10%脑组织匀浆。4 ℃, 4 000 r/min离心15 min, 弃除上清，充分混悬沉淀。4 ℃, 10 000 r/min离心10 min, 所得沉淀为线粒体。考马斯亮蓝法定量线粒体蛋白浓度。

1.2.2 脑线粒体呼吸链复合物活性的检测：脑线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均参照商品化试剂盒说明书进行实验，结果重复3次。

1.2.3 电镜标本的制作和观察：透射电镜标本的制作按常规流程进行[4], 在JEM1200电镜下观察海马CA1区线粒体的超微结构。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 脑线粒体呼吸链复合物的活性

与对照组相比, D-半乳糖组脑线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性均显著降低(表1)。

表1 脑线粒体呼吸链复合物的活性

2.2 海马区脑线粒体超微结构的改变

对照组脑线粒体呈椭圆形或圆形，其内嵴清晰可见，基质均匀(图1A)。D-半乳糖组脑线粒体的病理改变主要有: ① 线粒体的体积肿胀增大，嵴变短、减少或消失; ② 线粒体变性，主要为水变性，基质稀薄，可见空泡(图1B)。这些变性的线粒体除在既往报道的海马神经元和星形胶质细胞胞质中分布外[7], 还存在于突触密集区及星形胶质细胞的突起中(图1C)和脑毛细血管周围星形胶质细胞的终足中(图1D)。

A. 对照组 40000倍; B. D-半乳糖组 40000倍; C. D-半乳糖组突触密集区 25000倍; D. D-半乳糖组毛细血管区 25000倍

3 讨 论

目前，D-半乳糖模型已成为国内较公认的研究由氧化应激导致衰老的模型。本实验研究结果证实，脑线粒体形态和功能障碍参与了此动物模型的发病机制。较之既往仅在外周组织(如肝脏[8]、心肌[9])中探讨此模型上的线粒体损伤，本结果拓展了D-半乳糖研究的领域。结合以往和本实验结果推测，D-半乳糖诱导的氧化应激可能是脑线粒体形态和功能障碍的一个重要因素。

线粒体呼吸链是产生ROS的主要场所, ROS主要来源于呼吸链复合物Ⅰ～Ⅳ位点的超氧化阴离子的歧化。正常情况下下，线粒体内的多种抗氧化系统，诸如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白等可维持其内ROS的稳态[10]。然而在氧化应激状态下，线粒体也是ROS损伤的敏感靶标，过多的ROS会攻击线粒体呼吸链复合物，导致电子渗漏大量增加以及ATP水平的下降，进而引起蛋白质失活、脂质过氧化和mtDNA突变等，从而导致线粒体的功能异常，促进衰老和疾病的发生[11]。本实验也发现，模型组脑线粒体呼吸链复合物的活性下降。

在此基础上进一步调查海马CA1区脑线粒体超微结构的改变：模型组中肿胀扭曲、嵴断裂和空泡样变的变性线粒体广泛分布在神经元和星形胶质细胞内，神经元内线粒体的形态异常与功能障碍将对细胞产生一系列不利影响，如神经递质转运障碍、突触传导受阻等，从而导致此模型中广泛报道的认知和学习障碍。同时进一步观察星形胶质细胞突起内线粒体超微结构的损伤：星形胶质细胞是脑内还原型谷胱甘肽(GSH)产生的主要场所，而GSH作为脑中抗ROS的主要物质之一，能有效阻止其产生，保护神经元免受氧化应激的损伤[12]。但由于GSH的合成是一个典型的需要ATP酶的反应过程，星形胶质细胞内线粒体形态结构的损伤将扰乱GSH的正常代谢[13]。因此，星形胶质细胞线粒体的变性会降低星形胶质细胞的抗氧化能力，加重衰老及衰老相关疾病的发病进程。

综上所述，本实验证实脑线粒体形态异常和呼吸链复合物活性下降参与了D-半乳糖诱导的氧化应激对神经元的损伤，因此，应用特异性保护脑线粒体的药物可能有助于延缓脑衰老的发生发展。

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