AMP-18联合5-氨基水杨酸治疗大鼠结肠炎的效果

周 瑞，成宏伟，戴晓荣，周正斌，陈永康

(扬州大学附属泰兴人民医院，消化内科，江苏 泰兴，225400)

AMP-18是新发现的一种对胃肠黏膜有保护作用的蛋白质，其生理功能主要有促进胃肠黏膜上皮细胞的有丝分裂，促进细胞的迁徙，促进胃肠黏膜损伤的修复等[1-4]。炎症性肠病(IBD)指溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),是病因不明的慢性肠道炎症性疾病。由于IBD呈慢性反复发作过程，治愈十分困难,常给患者造成严重的经济和心理负担。目前治疗药物以抗炎、抑制免疫为主，但存在局限。因此，对于IBD的治疗而言，除抑制或减轻损伤以外，加强黏膜保护或促进损伤修复同样重要，至少应与其他药物联合应用。本试验观察 AMP-18对三硝基苯磺酸诱导的结肠炎大鼠是否具有肠黏膜保护作用，及其与5-ASA合用是否可增强疗效,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

AMP-18购自北京大学生命科学院; 5% 2，4，6TNBS和5-ASA均购自德国Sigma公司; S-P免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术公司；MPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠NF-KBp65单克隆抗体为SantaCruz公司产品。大鼠EGF的ELISA试剂盒购自美国ADL(Adlitteram Diagnostic Laboratories)公司。

1.2 TNBS结肠炎动物模型制备及处理

40只Sprague-Dawley(SD)成年雌雄大鼠，体质量165～210 g,由扬州大学实验动物研究中心提供。置于温度为(23±1) ℃的净化实验室内，混合食料喂养，常规性适应性饲养1周。随机抽取10只为正常对照组A组(雌雄各半)，剩余30只随机分成B、C、D组，每组尽量保证雌雄均衡。按文献方法建立大鼠结肠炎模型：实验前1 d禁食，用2%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，用金属灌肠管经大鼠肛门插入结肠深约8 cm，一次性注入TNBS/乙醇溶液0.6 mL制模(按100 mg/kg TNBS加上50%乙醇0.25 mL)，然后注入0.3 mL的空气，尽可能将黏附在灌肠管及注射器上的药液注入大鼠肠内。制模后第3天，各组分别给予不同处理: ① A组给予0.9%氯化钠溶液1 mL灌肠; ② B组给予5-ASA 1 mL灌肠(100 mg/kg); ③ C组给予AMP-18 10 mg/kg，皮下注射; ④ D组给予5-ASA和AMP-18各1 mL联合处理。

1.3 观察指标及测定方法

大鼠的一般状况：观察精神状态、毛发变化、活动状态、大便变化、体质量等。并进行疾病活动指数(DAI)评分。DAI=(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。大鼠结肠大体形态损伤评分：给药后第4、8天分别处死每组大鼠5只，取末端10 cm的结直肠沿肠系膜纵行剖开，观察大体形态改变，按Wallace-Keenan标准进行大体评分。大鼠结肠组织损伤评分：将结肠标本进行HE染色，采用Fedorak积分标准进行组织学评分。MPO活性检测：取远端结肠组织0.1 g，按质量体积比为1∶19加入均浆介质1.9 mL制备成5%的组织匀浆液。取5%组织匀浆液0.9 mL按试剂盒操作步骤进行检测。用UV-240IPC型紫外可见分光光度计于波长460 nm，1 cm光径，蒸馏水调零,测定各管吸光度(A)值，计算酶活力单位。每克组织在37 ℃的反应体系中被H2O2分解1 μmol为1个酶活力单位。结肠组织NF-kB免疫组化染色分析：取结肠病变部位组织，4%中性甲醛固定后石蜡包埋。将用黏片剂多聚赖氨酸处理后的玻片，取4 μm厚组织切片作免疫组化染色。NF-κB免疫组化染色操作步骤按SP试剂盒进行。结果判断: 细胞呈棕黄色为阳性，定位于细胞核和(或)细胞质。上皮细胞阳性结果计算方法：随机计数远端结肠(从肛门向上约4 cm)50个隐窝，计数每个隐窝的阳性细胞百分率，并按下述标准评分: ≤5%为0分; 6%～25%为1分，记+; 26%～50% 为2分，记2+; 51%～75%为3分，记3+; 76%～100%为4分，记4+。之后计算每只大鼠的平均得分。血清EGF检测：分别在用药后第4、8天每组各抽取5只大鼠，心脏取血，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清EGF浓度。具体方法及操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件包，实验数据以均数±标准差表示，采用ANOVA分析后进行Dunnett检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠灌肠后的一般状况

造模后的大鼠均出现食量下降，解稀便或黏液血便等消化道症状以及精神萎靡、体质量下降等全身改变。实验第0天，实验对照组大鼠平均体质量为(185±8) g，灌肠给药组为(194±9) g，2组间无显著差异。实验第4、8天，A组大鼠体质量平均减轻(10±2) g和(7±2) g，B、C和D组大鼠体质量增加，但B、C组体质量增加低于D组。

2.2 DAI评分

与对照组A组比较,给药组 B、C、D组的评分明显低于A组(P<0.05); 并且D组的评分明显低于B组和C组(P<0.05),但给药组B、C组之间比较无显著差异(P>0.05)。

2.3 大体形态损伤

大鼠结肠炎症病变主要靠近肛门段结肠，病变黏膜充血、水肿、糜烂和溃疡形成，部分肠壁增厚与周围组织粘连。B、C、D组结肠炎症病变明显轻于A组(P<0.01)，其中又以D组为最轻，且各组结肠炎病变用药第8天明显低于第4天(P<0.05)。

2.4 结肠组织学损伤

TNBS/乙醇造模后,组织学检查病变主要位于黏膜及黏膜下层,以中性粒细胞浸润为主,亦可见数量不等的巨噬细胞和嗜酸性粒细胞,黏膜糜烂及溃疡形成,且病变部位腺体排列不整齐，见图1。与A组比较,B、C、D各组大鼠结肠黏膜组织学损伤明显减轻,组织学损伤评分显著降低(P<0.01),且D组最低 (P<0.05)。见表1。

图1 TNBS/乙醇造模后结肠组织学变化低倍镜下观察

表1 各组在各个时期的参数关系比较

2.5 结肠组织MPO水平测定结果

炎症时，结肠组织中MPO水平增高；用药第4天后有所下降，用药第8天后下降更明显(P<0.05)，且B、C、D组MPO水平较对照组A组下降更显著 (P<0.01)，其中D组下降最明显(P<0.05),但给药组B、C组MPO下降水平比较无显著差异(P>0.05)。见表2。

2.6 NF-kB免疫组化染色结果

NF-kB主要表达在黏膜上皮细胞、单个核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的细胞质和细胞核中，且靠近结肠溃疡和糜烂部位阳性率高，见图2。实验后第4、8天，A组大鼠结肠组织NF-kB表达水平较高，而B、C、D组NF-kB表达明显降低，且D组大鼠结肠组织阳性率最低(P<0.05)，见表2。

图2 NF-kB免疫组化染色结果

2.7 血清EGF浓度的测定结果

用药组B，C，D的EGF的浓度明显高于实验对照组A组，且联合用药组D组的EGF浓度明显高于单独给药组B组或C组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时期各指标表达情况

3 讨 论

AMP-18是近年来发现的一种对胃黏膜有保护作用的蛋白质,其主要生理功能为促进胃黏膜上皮细胞的有丝分裂，促进细胞的迁徙，促进胃黏膜损伤的修复，保持胃黏膜的完整等[5]。但是，目前许多研究[6]显示AMP-18亦能促进肠黏膜损伤后的修复。Walsh-Reitz等[7]给小鼠皮下注射AMP-18后，发现可明显延迟右旋糖酐硫酸酯钠(DSS)引起的直肠黏膜损伤(如血便发生)的发生并可减少体质量下降的程度。进一步在细胞水平对上述现象进行研究，发现氯乙烷、吲哚美辛或DSS等黏膜损伤剂能引起人结肠上皮C2细胞单细胞层跨上皮电阻(TER)的下降,及细胞周围紧密连接蛋白、结合前肌动蛋白(perijunctional actin)含量的减少。而当在该细胞培养基中预先加入AMP-18后可明显减少黏膜损伤剂引起的TER下降，并促使TER的回复。此外，也能增加细胞周围紧密连接(TJ)相关蛋白(occludin，claudin-5，ZO-1、ZO-2)、上皮细胞钙黏蛋白的积累并减少它们的丢失，和通过稳定结合前肌动蛋白(perijunctional actin)来保持细胞层的完整性。由此可见，AMP-18对肠黏膜具有保护作用。本实验结果显示，经联合应用AMP-18与5-ASA对TNBS诱发的大鼠结肠炎有良好的治疗作用，其疗效优于单独应用AMP-18或5-ASA，提示AMP-18在TNBS诱发的大鼠结肠炎肠黏膜损伤修复中起重要作用。许多研究表明，炎症性肠病病变以溃疡和炎性细胞浸润为主。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶，主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中，可作为中性粒细胞的特异性标记物。Chadwick等研究发现肠黏膜MPO可作为炎症性肠病患者病情严重程度的监测指标。Saiki研究发现粪便中MPO活性是炎症性肠病病情活动的标志物。本实验中模型组MPO水平明显高于正常组，表明组织中有大量中性粒细胞浸润。给药组MPO有不同程度下降，说明AMP-18和5-ASA可降低MPO水平，减轻炎性细胞的浸润，从而减轻肠道炎症。众多资料显示，溃疡性结肠炎患者肠黏膜组织活检中NF-KB p65亚单位表达明显上调。NF-KB通过对细胞因子、黏附分子、趋化(化学)因子及其他炎性递质的调控在IBD炎症反应中起着关键作用。本组实验中作者观察到炎症时NF-kB表达增加，而应用AMP-18治疗后NF-kB表达下降，表明AMP-18可能通过NF-kB来发挥抗炎效应，其与NF-KB之间可能存在互相调节作用。表皮生长因子能促进多种上皮细胞的生长、创伤愈合、细胞的增殖分化，促进黏膜细胞DNA、RNA和蛋白质的合成，增加黏膜血流，促进黏液分泌，减轻腹泻等。Luck等对小鼠UC模型用EGF进行治疗,在UC形成后分别由直肠直接灌肠和体内注射EGF治疗7 d,结果发现体内注射EGF明显减轻了结肠的溃疡和炎症,而且明显减低了结肠组织中MPO的活性，说明体内注射EGF可以加快溃疡的愈合并有效地减轻炎症反应。本实验结果显示经AMP-18皮下注射和5-ASA灌肠治疗后，EGF表达增强，且存在时间和协同效应。在给药3 d后EGF的表达呈上升趋势，治疗1周后EGF表达上升更加明显，且联合应用AMP-18和5-ASA灌肠治疗组的EGF表达水平明显高于单独应用AMP-18和5-ASA治疗组。这说明联合应用AMP-18和5-ASA可以明显上调EGF的表达，促进受损区域上皮细胞的重建，加快上皮细胞的移行速度，从而促进结肠炎损伤黏膜的愈合。

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