快速高效从石蜡包埋肿瘤组织中提取micro-RNA方法的研究

李江超，杨 扬，郝卓芳，周晓明，章倩倩，王丽京*（.广东药学院血管生物研究所，广东 广州 50006；.广州医科大学第二附属医院病理科，广东 广州 5060；.广东药学院基础医学院，广东 广州 50006）

·论著·

快速高效从石蜡包埋肿瘤组织中提取micro-RNA方法的研究

李江超1，杨 扬1，郝卓芳2，周晓明3，章倩倩1，王丽京1*
（1.广东药学院血管生物研究所，广东 广州 510006；2.广州医科大学第二附属医院病理科，广东 广州 510260；3.广东药学院基础医学院，广东 广州 510006）

目的探索一种从石蜡包埋组织标本中快速、便捷、低成本的提取miRNAs的方法。方法收集2年内石蜡包埋的人乳腺癌组织和保存6个月的MMTV基因工程小鼠乳腺癌组织石蜡样本，同时选用进口A公司生产的提取石蜡组织miRNAs试剂盒作为对照；通过2种方法提取人和鼠的石蜡切片中miRNAs做对比分析，包括采用凝胶电泳验证，检测miRNA纯度、浓度分析。为了进一步验证其提取效果，采用定量PCR对所提取的总miRNAs进行miRNA-375和miR-218检测。结果①采用本实验方法从石蜡包埋乳腺癌组织中提取的miRNAs其纯度在1.86～2.21OD之间，其浓度可以满足常规实验要求（最低38.50mg/L）；②荧光定量PCR能够检测到miRNA-375和miRNA-218，其拷贝数与对照组比较，2种方法差异无统计学意义（P>0.05）。③该方法提取时间短、成本低，成本是试剂盒法的1/10，提取时间至少节省1/3。结论从石蜡包埋组织标本中提取miRNAs方法切实可行，为从石蜡组织样本提取miRNA进行分子诊断和肿瘤相关的研究提供了便利，对采用回顾性石蜡标本研究miRNAs提供了有力的帮助。

石蜡包埋组织；microRNAs;microRNA提取；乳腺癌

微小RNAs（miRNAs）是18～20bp的非编码RNA，在转录水平靶向3′端UTR（非翻译区）干扰特定基因的表达。miRNAs不同于mRNA的一个特性是不易被降解，石蜡包埋组织中miRNAs被用来做回顾性研究成为热点，另外，miRNA在分子诊断中被关注。石蜡包埋组织是医院最常用的保存标本方法，能够保存多年。近年来，越来越多的研究需要从石蜡组织中提取miRNA进行研究。关于提取miRNAs的产品已经商品化，但其方法和步骤仍旧繁琐冗长，且成本昂贵。鉴于上述问题，本研究基于miRNAs不降解特性和核酸提取原理，总结出快速、简单提取所需石蜡组织组织中的miRNAs方法，优化了实验步骤，加快了提取速度，降低了其成本，在临床或科研上有着实际应用价值，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源：2010年12月—2012年12月广州医学院附属第二医院病理科收集的20例乳腺癌手术患者的石蜡标本，患者全部为女性，年龄42～53岁，平均（48.0±3.2）岁。MMTV小鼠乳腺癌石蜡标本是广东医学院血管生物研究所2012年9月包埋的石蜡组织。提取时，将石蜡组织进行8μm切片备用。采购的试剂盒提取作为对照，本研究所用的miRNA提取方法作为实验组。

1.2 主要试剂和仪器：NaCl、RNA核酸收集柱购自北京天根生物技术公司，高速小型离心机、核酸蛋白浓度测量仪、miRNA石蜡组织提取试剂盒（A公司，美国）、RNA逆转录试剂购自广州复能生物科技有限公司，荧光定量SYBRgreenMix试剂购自Takara公司，miRNA375和miRNA218引物以及逆转录购自广州锐博生物技术有限公司。

1.3miRNA提取

1.3.1A公司试剂盒：石蜡包埋组织切取8μm切片，按照试剂盒说明书提取（本研究中简称方法A），具体步骤与A公司的石蜡组织miRNA提取试剂盒相一致。

1.3.2miRNA提取新方法（本研究中简称方法B）：①脱蜡，将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为8μm的组织片,取4片组织片置于无菌的1.5mL离心管内,加入1mL二甲苯或石蜡透明剂（上海宏兹生物公司）,漩涡振荡混匀,55℃水浴10min,室温条件下,12 000r/min离心3min,弃上清；加1mL无水乙醇,混匀,室温条件下，12 000r/min离心3min,弃上清,重复操作1次,所得样品37℃空气干燥20min。②蛋白消化，向步骤①所得样品中加入150μL消化缓冲液（含DNaseI酶）和10μL20mg/mL蛋白酶K,56℃水浴20min；85℃水浴10min。消化液配制，ProteinaseKbuffer250mL（1molTris-ClpH=8.0）2.5mL；0.5MEDTA（pH8.0）2.5mL；加水H2O定容至250mL）。③miRNA提取，冷却后，继续添加4mol的NaCl320μL，混合均匀，静止2min。然后加入1 120μL无水乙醇，吹打均匀，RNA离心柱过滤，12 000r/min离心1min，弃上清，加80%酒精吹均匀，12 000r/min离心10min。丢上清，室温干燥30min，20μL无核酶水溶解。④纯化、收集，加40μL的90℃预热的无核酸酶水，室温静置30min，12 000r/min离心1min，反复收集1次，可以提高获得率。

1.3.3SYBRgreenqPCR：将上述2种方法提取的miRNA，按照锐博公司提供的逆转录引物说明书进行逆转录，得到的cDNA用于荧光实时定量PCR检测。荧光定量实验操作按照TakaraqPCRMix说明书进行。PCR扩增反应条件为94℃预变性2min，94℃40s，62℃40s，72℃30s，40个循环。使用伯乐公司的荧光定量PCR仪检测。内参miRNA采用U6作对照。

2 结 果

2.1 琼脂糖电泳检测RNA的提取：使用电泳检测方法B和方法A提取的microRNAs（miRNAs）显示，形成彗星扫尾状亮区条带（图1）。初步说明采用本方法所述可以提取到总miRNAs。对照组第1～3泳道为A方法提取、第4～6泳道为B方法提取。样品RNA成彗星尾状条带，表明采用我们的方法提取到总miRNAs是可以用电泳检测到的。

图1 2种方法提取miRNAs凝胶电泳图对比

M.表示相对分子质量的大小（100、250、500、750、1 000、2 000bp）；1～3.A方法提取的结果;4～6.B方法提取的结果;1～6均呈现出慧星样电泳，表明用2%琼脂糖电泳检测，2种方法提取的效果无明显差别

Figure1TheanalysisoftotalmiRNAsextractedwithtwomethodsby2%agarosegelelectrophoresis

M.indicatingM2000marker（100，250，500，750，1 000,2 000bp）;andline1-3withAmethod;whileline4-6withBmethod;Line1-6ofthemiRNAsareshowntheaboutsamesmear.TheresultsshowedthemethodBwaseffectiveandmiRNAscouldbedetectednodifferencecomparingtomethodAby2%agarosegelelectrophoresis

2.2 提取的miRNAs的质量分析：为了验证方法B提取的miRNAs的质量，我们通过微量核酸测定仪检测其OD值，该方法提取的microRNA，无论是MMTV基因工程鼠乳腺癌石蜡组织还是人的乳腺癌石蜡组织，通过紫外分光光度计检测OD值以及计算260/280比值，结果提示其浓度完全可以满足PCR逆转录的需要（10ng～1μg）260/280比值>1.8，说明所提取的miRNAs在正常范围（OD值在1.8～2.2之间属于正常范围）。其石蜡标本的时间从2个月或2年的标本均可以满足需要，见表1。

表1 核酸检测仪检测的miRNA的纯度和浓度Table 1 The quality test of miRNAs extracted from MMTV mice paraffin samples and human breast cancer tissue by nucleic acid detector

2.3 提取的miRNAs可以用于特异性引物的检测：上述已经对该方法提取的miRNA质量进行检测，为了进一步检测该方法提取的miRNA是否可以特异性的应用于荧光定量PCR，对8个患者乳腺癌组织中的U6和miRNA-218进行验证，通过定量PCR分析，可以从图2中发现，其溶解曲线比较整齐，说明是引物特异性扩增，用方法B提取的miRNAs进行荧光定量PCR，所得miRNA均可以检测到内参U6和miR218的表达，其RT-PCR的融解曲线特异性好并且CT值接近。说明本方法能够取得miRNA可以应用于特异性引物的定量PCR检测。

图2 采用方法B从石蜡组织标本中提取的miRNA可以满足miRNA荧光定量的检测

采用方法B所获得的miRNA通过RT-PCR实验，可以检测到U6和miRN218，并且溶解曲线显示出引物的特异性

Figure 2 miRNAs extracted from paraffin tissue samples met the requirement of detection of miRNA by quantitative RT-PCR

miRNA obtained from B method could be detected the expression of U6,and miRNA-218 expression level also could be detected with RT-PCR and solubility curve illustrated the primers were specific

2.4 提取的microRNA阈值的检测：上述实验证明特异性引物从所提取的miRNAs可以扩增出目的基因，为了验证采用方法B所提取的miRNA和国外进口试剂盒提取的miRNA效率的差异，检测了相同的8个标本的miRNA-218和miRNA-375表达量的变化，U6作为内参，分别对其逆转录后进行荧光定量PCR检测。结果显示，2种方法提取的miR218和miR375差异无统计学意义，见表2。

GroupsmiRNA⁃218miRNA⁃375MethodA18．31±2．8923．10±3．22MethodB18．44±3．5724．51±2．79t0．0800．936P0．9370．365

2.5 2种miRNA提取方法的经济和效率的对比：方法B经济，成本大约每样品7.0元，而进口试剂盒每个样品是70元；提取周期B方法是2～2.5h，而进口试剂盒的A方法时间大约是5～6h。B方法费用是进口试剂盒的1/10，而时间也大约节省了2/3。

3 讨 论

在肿瘤研究中，回顾性实验研究必不可少，最丰富而又最容易获得的是石蜡包埋保存的肿瘤组织。而优化和简化从石蜡标本中提取miRNA的方法，对有效利用这些宝贵的临床资源进行深入研究有着重要意义[1-3]。

目前，提取miRNA多依赖进口试剂盒。国内也有部分厂家在生产miRNA提取试剂盒，本研究正是在实践的基础上，总结得出一种实用、节约时间、低成本的miRNA提取方法，主要针对石蜡组织的miRNA提取。本研究实验所需的各种试剂都是常规实验室的试剂，可以随时配制，成本低，取材方便。同时，本研究在提取MMTV小鼠[4]和人的标本中，差异无统计学意义，表明该方法提取的miRNA可以用于后续实验研究。也说明该方法小鼠和人的种属差异影响不大，通过同进口试剂盒作对比可见，本法提取的miRNA质量在正常范围之内，且定量PCR检测其溶解曲线，提示用其扩增miRNA具有一定特异性。为了验证实验的可用性和提取效率，又经逆转录聚合酶链反应（reverse transcripatse polymerase chain reaction,RT-PCR）验证其拷贝数变化，结果显示2种方法提取的miRNA中miRNA-218和microRNA-375的表达差异均无统计学意义[5-7]。该方法提取的石蜡样本中miRNA能够用于后续的RT-PCR实验。

石蜡标本在病理科是最重要的材料和患者档案，在回顾性或总结性研究中有着极其重要的作用，很多医院都建立了大量的存档福尔马林固定石蜡包埋样本库，为科研提供了有力的研究工具。然而，石蜡包埋样本RNA的提取存在一定难度，主要与甲醛固定、保存时间与条件等因素相关，导致RNA部分降解。目前已有众多学者针对样本的固定时间、不同固定剂、保存方法等方面研究对RNA分子的影响[8-11]。miRNA不易降解，对充分应用这些材料提供了依据。目前，提取miRNA的步骤多且成本高，对可行前瞻性或回顾性研究产生不利的影响。所以，新的提取技术能够补充原有的技术，加快提取速度，节约成本，为有效利用并预测预后的miRNA表达提供帮助。同时，miRNA的鉴别与临床特征、预后及筛选出相关靶向分子或调控异常路径等都有重要关系[12-14]。

综上所述，本研究所述新方法为今后开展大量FFPE样本提取miRNA进行分子生物学研究提供了实验依据。诚然，本方法尚需要进一步完善，以便更好地为临床和肿瘤研究提供帮助。

[1] 孙冰，郭晓红，江泽飞，等.乳腺癌冰冻和石蜡包埋样本的RNA以及基因表达情况的比较研究[J].临床肿瘤学杂志,2010,15（7）：588-592.

[2] 戴丹，徐燕丽.MicroRNA与恶性淋巴瘤相关性研究进展[J].河北医科大学学报,2009,30（10）:1106-1108.

[3] LIU A,XU X.MicroRNA isolation from formalin-fixed,paraffin-embedded tissues[J].Methods Mol Biol,2011，724:259-267.

[4] FRANCI C,ZHOU J,JIANG Z,et al.Biomarkers of residual disease,disseminated tumor cells,and metastases in the MMTV-PyMT breast cancer model[J].PLoS One,2013,8（3）:e58183.

[5] APPAIAH HN,GOSWAMI CP,MINA LA,et al.Persistent upregulation of U6:SNORD44 small RNA ratio in the serum of breast cancer patients[J].Breast Cancer Res,2011,13（5）:R86.

[6] PRUDNIKOVA TY,MOSTOVICH LA,KASHUBA VI,et al.miRNA-218 contributes to the regulation of D-glucuronyl C5-epimerase expression in normal and tumor breast tissues[J].Epigenetics,2012,7（10）:1109-1114.

[7] WARD A,BALWIERZ A,ZHANG JD，et al.Re-expression of microRNA-375 reverses both tamoxifen resistance and accompanying EMT-like properties in breast cancer[J].Oncogene,2013,32（9）:1173-1182.

[8] GODFREY TE，KIM SH，CHAVIRA M，et al.Quantitative mRNA expression analysis from formalin-fixed，paraffin-embeddod tissues using 5'nuclease quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction[J].J Mol Diagn，2000，2（2）：84-91.

[9] VON AHLFEN S，MISSEL A，BENDRAT K,et al.Determinants of RNA quality from FFPE samples[J].PLoS One，2007,2（12）：e1261.

[10] MASUDA N，OHNISHI T，KAWAMOTO S，et al.Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples[J].Nucleic Acids Res，1999，27（22）：4436-4443.

[11] GLOGHINI A，CANAL B，KLEIN U,et al.RT-PCR analysis of RNA extracted from Bouin--fixed and paraffin-embedded lymphoid tissues[J].J Mol Diagn,2004,6（4）：290-296.

[12] 唐海林，武明花.miRNA失调控与肿瘤的发生发展[J].中南医学科学杂志,2013,41（1）：1-6.

[13] 徐皓，张玉华，吴文溪.微RNA与肿瘤[J].国际肿瘤学杂志,2006,33（10）：731-733.

[14] 吴晨鹏.MicroRNA在结直肠肿瘤中的研究进展[J].河北医科大学学报,2013,34（3）：370-372.

（本文编辑：许卓文）

ANEFFICIENTANDRAPIDMETHODFORMICRORNAFROMPARAFFIN-EMBEDDEDTUMORTISSUE

LIJiangchao1,YANGYang1,HAOZhuofang2,ZHOUXiaoming3,ZHANGQianqian1,WANGLijing1*
（1.VascularBiologyResearchInstitute,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2.DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou
510260,China;3.BasicMedicalCollegeofGuangdongPharmacyCollege,Guangzhou510006,China）

ObjectiveTolookforbetterandlowcostmethodforextractingmicroRNAs（miRNAs）fromparaffin-embeddedtissueformiRNAdiagnosisorothermiRNAsassay.MethodsThesampleswerecollectedfromparaffin-embeddedhumanbreastcancertissuestoredovertwoyearsandMMTVtransgenicmouseparaffin-embeddedbreasttissueoversixmonths.ThemiRNAsextractparaffintissuekitservedascontrol.TodetectthequalityofmiRNAsobtainedbythesetwomethods,used2%gelelectrophoresisandtheODvaluetoconfirmthequalityandconcentration.Furthermore,verifiedmiRNAsbytestingmiRNA-375andmiRNA-218withquantitativePCR.Results①miRNAsextractedbyourmethodmettheexperimentalrequirements（A260/280=1.86-2.21OD）,andthelowestconcentrationwas38.50mg/L.②ThequantitativePCRcandetectmiRNAsanditscopiesnumbercomparedwiththecontrol，thedifferencewasnosignificant（P>0.05）.③Thismethodhasrelativelylowercost,about1/10costofkitmethod,whiletheextractionprocessdecreasedabout1/3time.ConclusionThemethodweoptimizedforextractedmiRNAsfromparaffin-embeddedtissueisfeasible,itprovidesaconvenientexperimentalmethod,andabetterapproachtodetectmoreretrospectivespecimensofparaffin-embeddedtissuesamples.

paraffin-embeddedtissue;microRNA;extraction;breastcancer

2013-08-01；

2013-09-10

国家自然科学基金项目（31271455）；广东省自然科学

基金项目（S2012040007658）；广东省医学科研基金项目（A2013312）

李江超（1976-），男，河北晋州人，广东药学院血管生物研究所助理研究员，理学博士，从事肿瘤学基础研究。

R737.9

A

1007-3205（2014）05-0541-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.015

*通讯作者