肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表达*

冯悦静,魏小玲,尤爱国,周安燕,吴拥军,王 威,何其栋,王 静#

1)郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院毒理学教研室 郑州 450001 3)河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 郑州 450016

肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表达*

冯悦静1),魏小玲2),尤爱国3),周安燕1),吴拥军2),王 威2),何其栋2),王 静1)#

1)郑州大学第一附属医院呼吸内科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院毒理学教研室 郑州 450001 3)河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 郑州 450016

#通讯作者，女，1958年11月生，博士，教授，研究方向：肺癌的发病机制和早期预警，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn

肺,肿瘤；DNA甲基化转移酶；组蛋白去乙酰化酶1

目的：研究肺癌患者血清中DNA甲基化转移酶(DNMT)1、DNMT3a、DNMT3b和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白的表达情况。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定136例肺癌患者、140例肺良性疾病及145例健康体检者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表达，并分析DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表达与肺癌临床病理特征的关系。结果3组血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表达差异有统计学意义(F=3.281、62.510、37.273、57.721，P<0.05)，肺癌患者均高于正常对照及肺良性疾病患者；非条件logistic回归分析提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表达均可影响肺癌的发生发展(P<0.001)；肺癌患者血清中DNMT1、DNMT 3a、DNMT 3b和HDAC1蛋白表达无组织学类型特异性(P>0.05)，但不同临床分期其蛋白表达差异有统计学意义(t=0.843、0.244、0.222、0.878，P<0.05)。结论肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的高表达可能在肺癌的发生发展中发挥一定的作用。

表观遗传学是近年来研究肺癌发生的热点，包括基因组DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控(miRNA)等。DNA甲基化是通过DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成的[1]。组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases 1,HDAC1)是Taunton等[2]发现的第一个哺乳动物的组蛋白去乙酰化酶，它是多种蛋白质复合物的催化亚单位，参与组蛋白乙酰化水平的调控。两者异常导致的基因组稳定性下降、抑癌基因功能丧失、原癌基因活性增高在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。新近研究[3-5]发现DNMT及HDAC1抑制剂在肿瘤治疗中疗效显著，提示DNMT及HDAC1蛋白表达在肿瘤研究中有重要价值。既往研究多集中于肺癌组织中HDAC1和DNMTs蛋白表达。该研究通过ELISA方法检测DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌、肺良性疾病患者及正常人血清中的表达，探讨其可能的临床意义。

1 对象与方法

1.1研究对象136例肺癌患者来自郑州大学第一附属医院呼吸内科，其中男70例，女66例，年龄36～74(60.6±9.6)岁；吸烟者74例，不吸烟者62例；组织学类型：鳞癌53例，腺癌35例，其他48例。TNM分期(2009年肺癌国际分期修订版)：Ⅰ期21例，Ⅱ期80例，Ⅲ期23例，Ⅳ期12例；患者均未接受放、化疗和免疫治疗。全部患者均经病理学确诊。140例肺良性病变患者来自郑州市第六人民医院肺科,其中男71例，女69例，年龄29～76(56.8±18.8)岁；吸烟者77例，不吸烟者63例；肺结核69例，慢性支气管炎12例，肺部感染26例，支气管扩张23例，支气管哮喘 10例。145例正常对照者为同期郑州市第六人民医院体检科体检的健康人，其中男75 例，女70例，年龄31～71(57.7±19.1)岁；吸烟者79名，不吸烟者66名。该研究经郑州大学第一附属医院和郑州市第六人民医院临床伦理委员会批准，所有受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2标本收集所有研究对象均于清晨空腹抽取静脉血3 mL，置于干燥管内，37 ℃水浴30 min，然后3 000 r/min、4 ℃下离心3 min，取血清于EP管中，-80 ℃冰箱冻存备测。

1.3血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表达的检测采用ELISA法进行检测。Wellscan MK3酶标仪、Wellwash MK2洗板机(美国Thermo公司)；96孔可拆式酶标板(浙江省临海市化为分析器有限公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；DHP-600型电热恒温培养箱(北京市光明医疗仪器厂)；DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1 ELISA试剂盒(北京鼎国生物研究有限公司)。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学处理应用SPSS 12.0进行分析。收集受试者吸烟史等，其中吸烟定义为每天吸烟≥1支，持续半年以上[6]。3组受试者血清和不同临床病理特征肺癌患者DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表达的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验；采用非条件logistic回归分析血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表达与肺癌危险性的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组受试者血清DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白的表达水平见表1。

表1 3组受试者血清DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1蛋白表达水平 μg/L

*:与正常对照组比较，P<0.05；#：与肺良性病变组比较，P<0.05。

2.2肺癌的影响因素分析相关变量的赋值见表2(蛋白按对照组的中位数为分界点)。年龄、性别、吸烟史及血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、HDAC1水平高均是肺癌发生发展的影响因素，见表3。

表2 变量与赋值

表3 肺癌影响因素的非条件logistic回归分析结果

2.3不同临床病理特征肺癌患者血清HDAC1和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达的比较见表4。

表4 不同临床病理特征肺癌患者HDAC1和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达的比较 μg/L

3 讨论

在哺乳动物体内，DNA甲基化是通过DNMT催化作用，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶核苷酸的嘧啶环第5位碳原子甲基化，形成CpG岛[1]。目前发现DNMT家族，尤其是DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在DNA初始甲基化及甲基化维持中发挥重要作用[7-9]，其活性的异常参与了肿瘤的发生发展过程，是导致抑癌基因发生甲基化的重要因素。Lin等[10]研究已证实在肿瘤组织中抑癌基因启动子区高甲基化与DNMT蛋白表达水平密切相关，在多种肿瘤中都明显升高，尤其在有吸烟史肺癌患者中，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达显著增高，并且DNMT1蛋白高表达的患者预后不良。Kim等[11]对102例非小细胞肺癌进行研究，结果发现DNMT1和DNMT3b mRNA表达提高，同时检出相关抑癌基因高甲基化。与异常甲基化类似，组蛋白修饰在基因表达的调节中同样扮演重要角色。组蛋白乙酰化的失衡将引起相应的染色体结构和基因转录水平的改变，并影响细胞周期、细胞分化及凋亡，进而导致肿瘤的发生。HDAC1使组蛋白去乙酰化，与DNA紧密结合，染色质呈致密卷曲的阻抑结构，从而抑制基因转录，参与肿瘤的发生发展[2]。Sasaki等[12]在102例NSCLC标本中，发现Ⅲ期和Ⅳ期患者的HDAC1蛋白的表达明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，而在肿瘤和邻近非肿瘤组织中的表达无明显差别。

该研究结果显示肺癌组血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白的表达均高于正常人及肺良性疾病患者。与刘启明[13]的研究结果相一致，提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌的发生中可能起重要作用。

该研究非条件logistic回归分析结果提示，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表达均是肺癌的影响因素，这与DNMT1在其他恶性肿瘤如肝癌、肺腺癌、肾癌[14]、卵巢癌[15]中表达的研究结果相一致。

另外，该研究还分析了DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肺癌不同组织学类型及分期中的表达，结果显示不同组织学类型的肺癌DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表达无显著差异。Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者血清中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白表达水平明显高于Ⅲ、Ⅳ期。与孙云晖等[16]的报道一致。提示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白高表达可能是肺癌发生发展过程中的重要分子事件。

总之，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和HDAC1蛋白在肿瘤发生发展的具体机制究竟如何，尚需进一步的研究。

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(2013-08-07收稿 责任编辑李沛寰)

Expressions of DNMT1,DNMT3a,DNMT3b and HDAC1 in serum from patients with lung cancer

FENGYuejing1),WEIXiaoling2),YOUAiguo3),ZHOUAnyan1),WUYongjun2),WANGWei2),HEQidong2),WANGJing1)

1)DepartmentofRespiratoryDisease,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

3)InstituteofInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

lung，neoplasm;DNA methyltransferase;histone deacetylases 1

Aim: To study the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in serum from patients with lung cancer. Methods: ELISA was used to measure the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in the serum from 136 lung cancer patients,140 cases of lung benign diseases and 145 healthy people (control group), and the relationship between the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, HDAC1 and clinical characteristics of lung cancer was analyzed. Results:The expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 in patients with lung cancer were higher than those in lung benign diseases group and control group(F=3.281，62.510，37.273，57.721，P<0.05). The result of logistic regression showed that the overexpressions of DNMT1, DNMT3a，DNMT3b and HDAC1 might increase the risk of lung cancer (P<0.001). There were no correlations among the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b or HDAC1 between different histological types (P>0.05)，while there were statistical significances in the expressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 between different stages (t=0.843，0.244，0.222，0.878，P<0.05).Conclusion: The overexpressions of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HDAC1 could contribute to the occurrence and development of lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.008

*国家自然科学基金资助项目 30972457；河南省重大科技攻关项目 112102310102

R734.2