氧化型低密度脂蛋白对小鼠骨髓间充质干细胞迁移的影响*

武俊芳，牛 杰，李晓鹏，张芬熙，林俊堂，任同明，汪艳丽

1)新乡医学院形态学实验室 新乡 453003 2)新乡医学院第三附属医院眼科 新乡 453003 3)新乡医学院三全学院解剖学教研室 新乡 453003 4)新乡医学院干细胞与生物治疗研究中心 新乡 453003 5)新乡医学院解剖学实验室 新乡 453003

氧化型低密度脂蛋白对小鼠骨髓间充质干细胞迁移的影响*

武俊芳1)，牛 杰1)，李晓鹏2)，张芬熙3,4)#，林俊堂4)，任同明5)，汪艳丽1)

1)新乡医学院形态学实验室 新乡 453003 2)新乡医学院第三附属医院眼科 新乡 453003 3)新乡医学院三全学院解剖学教研室 新乡 453003 4)新乡医学院干细胞与生物治疗研究中心 新乡 453003 5)新乡医学院解剖学实验室 新乡 453003

#通讯作者，女，1978年8月生，硕士，讲师，研究方向：干细胞研究，E-mail：fxzhang0824@gmail.com

氧化型低密度脂蛋白；骨髓间充质干细胞；细胞迁移；细胞骨架；钙离子；小鼠

目的：研究氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对小鼠骨髓间充质干细胞(bmMSCs)迁移的影响。方法观察小鼠bmMSCs对ox-LDL的摄取能力。应用不同质量浓度(0、5、10和20 mg/L)ox-LDL诱导培养bmMSCs 6 h后，利用Transwell系统检测bmMSCs跨内皮迁移率，流式细胞仪检测ox-LDL细胞内钙离子阳性率，激光共聚焦显微镜检测细胞骨架F-actin在细胞内的分布。结果小鼠bmMSCs具有较强的摄取ox-LDL的能力。0、5、10和20 mg/L ox-LDL处理组bmMSCs跨内皮迁移率分别为(26.663±1.575)%、(34.653±2.693)%、(38.238±3.050)%和(42.833±3.748)%，钙离子阳性率分别为(42.375±4.281)%、(66.203±5.416)%、(77.958±4.338)%和(84.638±4.768)%，组间比较差异均有统计学意义(F=22.576、63.819，P<0.001)。ox-LDL可促进细胞骨架F-actin的重组。结论ox-LDL可通过调节细胞骨架重组和胞内钙离子阳性率促进bmMSCs的迁移。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bmMSCs)是一类具有多向分化潜能的多功能成体干细胞，在特定环境下可向多种功能细胞分化[1]。bmMSCs移植是目前生物医学治疗研究领域的重要课题。相关研究[1-3]显示，bmMSCs移植对阿尔茨海默病、心肌梗死、中风、骨肿瘤和肺损伤等多种疾病均有一定的疗效。但近期研究[4]显示，在静脉注射后仅有不到1.5%的bmMSCs能迁移到病灶部位。细胞归巢率低的问题大大限制了bmMSC移植的临床应用和疗效。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)为一类体内氧化型脂质微粒，是诱导体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的主要因素之一[5]。凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(lectin-like ox-LDL receptor 1，LOX-1)是ox-LDL的主要受体之一[5]。作者的前期研究[6]结果显示，LOX-1高表达于小鼠bmMSCs，且能介导间充质干细胞摄取ox-LDL。相关研究[7]显示，ox-LDL可通过活化LOX-1而活化细胞一系列生理信号，促进多种细胞的迁移。但ox-LDL是否影响小鼠bmMSCs的迁移目前还不清楚。该研究旨在探讨ox-LDL对小鼠bmMSCs迁移的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1材料Fluo-3/AM，Rhodamine phalloidin和ProlongH Gold antifade reagent with DAPI购自Invitrogen公司(美国)。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗和FITC标记的CD90抗体均购自Abcam公司(美国)。ox-LDL和Dil标记的ox-LDL购自Biomedical Technologies公司(美国)。HyClone血清购自Thermo Fisher Scientific公司(美国)。Transwell plates(8 μmol/L)购自Conning Costar公司(美国)。

1.3ox-LDL摄取实验将第3代小鼠bmMSCs接种到24孔板中常规培养。24 h后，向培养基中添加5 mg/L Dil标记的ox-LDL，培养箱中孵育30 min。PBS洗涤3次后，荧光显微镜下观察并拍照。

1.4细胞迁移实验将4×104L-1的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接种到Transwell的上室中，常规培养24 h；将经不同质量浓度(0、5、10和20 mg/L)ox-LDL诱导培养6 h后的bmMSCs接种到上室中，再培养6 h，计数迁移到小室下壁的细胞数量，并计算细胞跨内皮迁移率。每组均设5个复孔。

1.5细胞内钙离子阳性率检测将小鼠bmMSCs接种到6孔板中，分别用0、5、10和20 mg/L的ox-LDL诱导培养6 h。然后，向培养基中添加终浓度为5 μmol/L的Fluo-3/AM，避光37 ℃孵育30 min。PBS洗涤细胞3次，2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集细胞。PBS洗涤1次后，将细胞悬浮于500 μL PBS中，吹打混匀，上流式细胞仪分析，计算荧光强度(钙离子阳性率)。每组均设5个复孔。

1.6细胞骨架检测将bmMSCs接种到24孔板中，立即用不同质量浓度(0、5、10和20 mg/L)ox-LDL处理6 h。然后，PBS洗细胞2次，体积分数为4%中性福尔马林固定细胞，Triton X-100处理细胞10 min，再利用罗丹明标记的鬼笔环肽染色检测细胞骨架F-actin，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.7统计学处理采用SPSS 11.5进行分析，应用单因素方差分析和Turkey检验比较4组小鼠bmMSCs跨内皮迁移率和钙离子阳性率，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1小鼠bmMSCs的形态、鉴定及对ox-LDL的摄取免疫荧光染色显示，小鼠bmMSCs阳性表达间充质干细胞特异性标记分子CD90(图1A～C)。光镜下，第3代小鼠bmMSCs呈典型的梭形或长梭形成纤维细胞形态(图1D)。荧光检测显示，小鼠bmMSCs具有很强的摄取ox-LDL的能力(图1E～F)。

图1 小鼠bmMSCs的形态、鉴定及其对Dil-ox-LDL的摄取(×100)

A：DAPI染色显示小鼠bmMSCs核形态； B：免疫荧光染色显示CD90(FITC)在小鼠bmMSCs内的表达；C：DPAI 荧光染色和FITC荧光染色的合成图片；D：相差显微镜图像显示小鼠bmMSCs的形态；E：小鼠bmMSCs对Dil标记的(红色)ox-LDL的摄取；F：相差图像和Dil荧光的合成图片。

2.2不同质量浓度ox-LDL培养对小鼠bmMSCs跨内皮迁移率和钙离子阳性率的影响见表1。如表1所示，与0 mg/L ox-LDL处理组比较，5、10和20 mg/L ox-LDL处理组bmMSCs跨内皮细胞迁移率和钙离子阳性率均显著增加，且具有剂量效应。

2.3ox-LDL对小鼠bmMSCs骨架F-actin的影响见图2。ox-LDL可促进bmMSCs沿培养瓶壁伸展、生长，促进F-actin的重新组装(F-actin纤维长度增加，且排列更有序)。

表1 不同质量浓度ox-LDL培养对小鼠bmMSCs跨内皮迁移率和钙离子阳性率的影响(n=5)

*:与0 mg/L ox-LDL处理组相比，P<0.05；#:与5 mg/L ox-LDL处理组相比，P<0.05；△：与10 mg/L ox-LDL处理组相比，P<0.05。

图2 ox-LDL对小鼠bmMSCs骨架F-actin的影响(×400)

3 讨论

间充质干细胞具有很强的可塑性，可向多种功能细胞分化，是细胞移植术中最常用的种子细胞。目前，bmMSC移植已广泛应用于多种疾病的治疗，但预期疗效并不理想，其中，移植后bmMSC归巢率低是一个主要影响因素[4]。以往研究[7-8]显示，ox-LDL可促进细胞趋化因子的表达和多种细胞的迁移。作者的研究结果显示，小鼠bmMSCs具有很强的摄取ox-LDL的能力，经ox-LDL诱导培养后的小鼠bmMSCs迁移能力显著增加，且具有剂量效应，这说明ox-LDL可调节间充质干细胞的生理功能。

细胞骨架结构是细胞变形、运动和迁移的重要动力学基础。动态性细胞骨架重组是细胞迁移的前提条件。细胞靠骨架的不断解聚和重聚合，通过形成伪足，推动细胞向前移动。肌动蛋白纤维F-actin是细胞骨架的重要组成部分，该研究结果显示ox-LDL可明显促进F-actin在bmMSCs中的重组，使F-actin排列更加有序，这说明ox-LDL可促使接种后bmMSCs(消化后为圆形)沿培养瓶壁伸展、生长和细胞形态恢复。需要注意的是，其他课题组研究[9]显示高质量浓度ox-LDL(100 mg/L)也能造成其他种类细胞(如平滑肌细胞)的骨架结构解聚，抑制细胞迁移和诱导细胞的凋亡。所以，在应用ox-LDL诱导bmMSCs迁移时，要尽量控制ox-LDL的质量浓度，避免过高含量对细胞迁移和其他生理功能的损伤。

细胞内钙离子是调节细胞迁移的另一个重要影响因素。此外，细胞内钙离子也是细胞骨架重组的调节因子，钙离子介导的细胞迁移依赖于其对细胞骨架重组的调节作用[10]。以往研究[11]已证实，ox-LDL有促进细胞外钙离子内流的作用。该研究显示，伴随着细胞迁移能力的增加，细胞内钙离子的浓度也随之增加，且具有剂量效应。这说明，ox-LDL对bmMSCs迁移能力的影响可能依赖于其对细胞内钙离子的调节。

总之，该研究显示，ox-LDL可促进小鼠bmMSCs的迁移，该作用与其调节bmMSCs骨架结构重组和细胞内钙离子浓度有一定关系。

[1]李海生,陈振锋,牟心红.骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病研究进展[J].中国老年学杂志,2010,30(24):3829

[2]方翔,汤兵祥,张曼林,等.骨髓间充质干细胞移植对肺气肿大鼠的影响[J].郑州大学学报:医学版,2010,45(3):395

[3]Bersani G,Marconi D,Limpido L,et al.Pilot study of light therapy and neurocognitive performance of attention and memory in healthy subjects[J].Psychol Rep,2008,102(1):299

[4]Hu X,Wei L,Taylor TM.et al.Hypoxic preconditioning enhances bone marrow mesenchymal stem cell migration via Kv2.1 channel and FAK activation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,301(2):C362

[5]Lu J,Mitra S,Wang X,et al.Oxidative stress and lectin-like ox-LDL-receptor LOX-1 in atherogenesis and tumorigenesis[J].Antioxid Redox Signal,2011,15(8):2301

[6]Zhang F,Wang C,Jing S,et al.Lectin-like oxidized LDL receptor-1 expresses in mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells and stimulates their proliferation[J].Exp Cell Res,2013,319(7):1054

[7]Liu J,Ren Y,Kang L,et al.Oxidized low-density lipoprotein increases the proliferation and migration of human coronary artery smooth muscle cells through the upregulation of osteopontin[J].Int J Mol Med,2014,33(5):1341

[8]张巧丽,闫辉,唐朝枢,等.硫化氢抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的人巨噬细胞单核细胞趋化蛋白-1分泌的作用[J].实用儿科临床杂志,2012,27(7):513

[9]Massaeli H,Hurtado C,Austria JA,et al.Oxidized low-density lipoprotein induces cytoskeletal disorganization in smooth muscle cells[J].Am J Physiol,1999,277(5 Pt 2):H2017

[10]Joseph N,Reicher B,Barda-Saad M.The calcium feedback loop and T cell activation: how cytoskeleton networks control intracellular calcium flux[J].Biochim Biophys Acta,2014,1838(2):557

[11]Kuda O,Pietka TA,Demianova Z,et al.Sulfo-N-succinimidyl oleate (SSO) inhibits fatty acid uptake and signaling for intracellular calcium via binding CD36 lysine 164: SSO also inhibits oxidized low density lipoprotein uptake by macrophages[J].J Biol Chem,2013,288(22):15547

(2013-11-07收稿 责任编辑赵秋民)

Effect of oxidized low-density lipoprotein on migration of mouse bone marrow-derived stem cells

WUJunfang1),NIUJie1)，LIXiaopeng2)，ZHANGFenxi3,4)，LINJuntang4)，RENTongming5)，WANGYanli1)

1)LaboratoryofMorphology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 2)DepartmentofOphthalmology,theThirdAffiliatedHospital，XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 3)DepartmentofAnatomy,SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 4)StemCellandBiotheraphyTechnologyResearchCenter,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003 5)LaboratoryofAnatomy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003

oxidized low-density lipoprotein;bone marrow mesenchymal stem cell;cell migration;cytoskeleton;calcium ion;mouse

Aim: To investigate the effect of oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL) on migration of mouse bone marrow mesenchymal stem cells(bmMSCs). Methods: bmMSCs were cultured in growth medium with different concentrations (0, 5, 10 and 20 mg/L) of ox-LDL for 6 hours. The transendothelial migration rate of bmMSCs was measured using a Transwell system. The distribution of F-actin in bmMSCs was detected using a laser scanning confocal microscope following Rhodamine phalloidin staining. The concentrations of calcium ion (Ca2+) in bmMSCs was measured using a flow cytometer following Fluo-3/AM staining. Results: bmMSCs had high potential to take up ox-LDL. The transendothelial migration rate was (26.663±1.575)%,(34.653±2.693)%, (38.238±3.050)% and (42.833±3.748)% in control group, 5, 10 and 20 mg/L ox-LDL groups; there was significant differences among control group and the other 3 ox-LDL groups(F=22.576，P<0.001). The flow cytometry analysis showed that the positive rate of Ca2+was (42.375±4.281)%,(66.203±5.416)%，(77.958±4.338)% and (84.638±4.768)% in control group, 5, 10 and 20 mg/L ox-LDL groups; there was significant difference among control group and the other 3 ox-LDL groups(F=63.819，P<0.001). Furthermore, ox-LDL also promoted reorganization of F-actin cytoskeleton. Conclusion: Ox-LDL can promote migration of bmMSCs via regulation of cytoskeleton organization and Ca2+positive rates.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.003

*河南省教育厅自然科学基金资助项目 2010A310006

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