羟基喜树碱脂质体与顺铂联用对耐顺铂的人食管癌Eca109细胞周期和凋亡的影响*

戴翠萍，张徐宁，薛彩萍，刘家秀，张玉领，杨学艺，陈文中，季宁东

1)淮阴卫生高等职业技术学校淮安市消化道肿瘤重点实验室 淮安 223300 2)南京思科药业有限公司 南京 210061

羟基喜树碱脂质体与顺铂联用对耐顺铂的人食管癌Eca109细胞周期和凋亡的影响*

戴翠萍1)△，张徐宁1)，薛彩萍1)，刘家秀1)，张玉领1)，杨学艺1)，陈文中2)，季宁东1)

1)淮阴卫生高等职业技术学校淮安市消化道肿瘤重点实验室 淮安 223300 2)南京思科药业有限公司 南京 210061

△女，1972年10月生，硕士，副教授，研究方向：消化道肿瘤，E-mail：38224722@qq.com

羟基喜树碱脂质体；顺铂；食管癌；细胞周期；细胞凋亡

目的：研究羟基喜树碱脂质体(LHCPT)与顺铂(DDP)联用对耐DDP的人食管癌细胞Eca109细胞(Eca109/DDP)细胞周期和凋亡的影响。方法取对数生长期的Eca109/DDP细胞，分别用0、1 mg/L DDP处理，再用0.00、0.49、0.98、1.96、3.92、7.84 μg/L LHCPT处理72 h，MTT法测定细胞增殖状况。取对数生长期的Eca109/DDP细胞，分别用0、1 mg/L DDP处理后，再用0.00、3.92 μg/L LHCPT处理72 h，用流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡情况。结果相对于单独应用，LHCPT与DDP联合应用抑制了Eca109/DDP细胞的增殖(FLHCPT=40.330，FDDP=641.010，F交互=20.330，P均<0.001)，以3.92 μg/L LHCPT与1 mg/L DDP联用效果最佳(P<0.05)。相对于单独应用，3.92 μg/L LHCPT与1 mg/L DDP联用可阻滞Eca109/DDP细胞在G0/G1期(FLHCPT=16.184，FDDP=33.660，F交互=15.100，P均<0.05)，同时增加细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率(P均<0.05)，二者具有协同效应。结论LHCPT具有辅助DDP治疗食管癌的作用。

食管癌是临床常见的恶性肿瘤之一，严重危害人体健康。顺铂(cisplatin，DDP)为临床治疗食管癌的主要化疗药物之一，但往往因多药耐药(multidrug resistance，MDR)影响了其对耐药细胞株的疗效。研究发现，抗肿瘤药物的疗效主要取决于其激活细胞凋亡的能力[1]，而脂质体具有促进肿瘤细胞凋亡的作用[2-3]，但未见羟基喜树碱脂质体(hydroxycamptothecin liposome，LHCPT)对食管癌耐药细胞作用的研究报道。作者用耐DDP的食管癌细胞Eca109/DDP为模型，观察LHCPT与DDP联合应用对Eca109/DDP细胞周期和细胞凋亡的影响，为将LHCPT用于临床食管癌的辅助化疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要仪器、药品和试剂LHCPT(南京思科药业有限公司)，注射用DDP(规格5 g/L，山东齐鲁制药有限公司)，RPMI 1640(美国 Gibco公司)，MTT(美国 Amresco公司)，DMSO(上海久亿化学试剂有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。细胞凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。酶标仪(美国 BioTek ELx800)，Western电泳仪(美国 Bio-Rad 164-5051)，高速冷冻离心机(德国 SORVALL D-37520)，CO2恒温细胞培养箱(日本 SANYO XD-101)，流式细胞仪(美国 FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.2细胞株食管癌细胞株Eca109购自南京凯基生物科技发展有限公司，耐DDP食管癌细胞株Eca109/DDP由实验室用递增药物质量密度持续作用诱导法诱导Eca109细胞6个月构建而成，耐药指数为15.89[4]。细胞用含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于37 ℃、饱和湿度及体积分数5%CO2的细胞培养箱内培养。

1.3LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞增殖影响的观察取对数生长期的Eca109/DDP细胞，以2.5 g/L的胰酶消化，调整细胞密度为5×104mL-1，5×103个/孔接种于96孔细胞培养板，培养24 h后，分别用0、1 mg/L的DDP处理，再用0.00、0.49、0.98、1.96、3.92、7.84 μg/L的LHCPT处理，每组5个复孔。培养72 h后，MTT法测定各孔吸光度(A)。

1.4LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞周期和细胞凋亡影响的观察取对数生长期的细胞，胰酶消化，调整细胞浓度为1×106mL-1，1×106个/孔接种于6孔细胞培养板，培养24 h后，分别用0、1 mg/L的DDP处理，再用0.00、3.92 μg/L的LHCPT处理，每组5个平行复孔。培养72 h后，用流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡情况[5]。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0处理数据，应用析因设计的方差分析比较LHCPT、DDP单用及联用对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡影响的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞增殖的影响各组MTT法测得的A值见表1。结果显示，相对于DDP单独应用，LHCPT与DDP联用抑制了Eca109/DDP细胞的增殖，以3.92 μg/L LHCPT与1 mg/L DDP联用效果最佳。

表1 LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞增殖的影响

FLHCPT=40.330，FDDP=641.010，F交互=20.330，P均<0.001。

2.2LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞周期的影响各组细胞周期测定结果见表2。结果显示，相对于DDP单独应用，LHCPT与DDP联用组G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，LHCPT与DDP具有协同效应。

表2 LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞周期的影响 %

2.3LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞凋亡的影响各组细胞凋亡测定结果见表3。结果显示，相对于DDP单独应用，LHCPT与DDP联用组Eca109/DDP细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率均增加，LHCPT与DDP具有协同效应。

表3 LHCPT、DDP单用及联用对Eca109/DDP细胞凋亡的影响 %

3 讨论

肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因相互作用的结果，在生物学上表现为细胞凋亡障碍和细胞周期调控机制的紊乱。研究[6-10]表明，诱导食管癌细胞凋亡和周期改变可抑制食管癌细胞的增殖。因此选择有效药物诱导食管癌细胞凋亡和周期改变是提高食管癌疗效的关键因素之一。

脂质体作为药物载体在药物传递系统中的研究较多，其本身对人体无毒性和免疫抑制作用，但具有明显的靶向作用、缓释作用、生物膜亲和性和组织相容性、提高药物稳定性的特点。国内外研究表明脂质体具有促进细胞凋亡[2-3]和逆转肿瘤MDR的作用[11-13]。作者将LHCPT与临床一线抗癌药DDP联合应用，观察其对耐DDP的食管癌细胞Eca109/DDP的增殖抑制作用，并探讨其机制。研究结果表明，LHCPT与DDP联合应用对Eca109/DDP细胞的增殖抑制有协同效应，以3.92 μg/L LHCPT与1 mg/L DDP联合应用对Eca109/DDP细胞的增殖抑制作用最强。进一步对细胞周期和细胞凋亡的检测结果显示，与单独应用相比，3.92 μg/L的LHCPT与1 mg/L DDP联合应用组G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，同时细胞早期凋亡率和晚期凋亡率、总凋亡率均显著增加。研究结果说明LHCPT与DDP联合应用能诱使Eca109/DDP细胞发生G0/G1期阻滞，通过改变Eca109/DDP细胞周期、增加细胞凋亡，从而抑制Eca109/DDP细胞的增殖，LHCPT与DDP有明显的协同效应。临床上如果将LHCPT与DDP联合应用可起到提高DDP药效、降低DDP用药剂量的作用，这将有助于克服单独应用DDP所引起的毒副作用大、容易发生耐药等缺点，两药联用将会使DDP的应用更加安全，低浓度的LHCPT具有辅助DDP治疗食管癌的潜力。

目前认为细胞凋亡存在三条通路，即线粒体通路[14]、死亡受体通路[15]和内质网通路[16]，三条通路间密切关联。其中，线粒体被视为细胞死亡调控的关键元件，是多种促细胞凋亡信号转导分子的靶点。LHCPT与DDP联用对Eca109/DDP细胞凋亡通路的影响将是进一步研究的方向，同时今后也要进一步加强两药联用对食管癌实体瘤影响的研究。

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(2013-08-18收稿 责任编辑王 曼)

Effects of hydroxycamptothecin liposome combined with cisplatin on cell cycle and apoptosis of cisplatin-resistanted human esophageal carcinoma Eca109 cell

DAICuiping1),ZHANGXuning1),XUECaiping1),LIUJiaxiu1),ZHANGYuling1),YANGXueyi1),CHENWenzhong2),JINingdong1)

1)Huai’anKeyLaboratoryofTumorinDigestiveSystem,HuaiyinAdvancedVocationalandTechnicalHealthSchool,Huai’an223300 2)NanjingSikeMedicalCo.Ltd.，Nanjing210061

hydroxycamptothecin liposome;cisplatin;esophageal carcinoma;cell cycle;cell apoptosis

Aim: To investigate the effects of hydroxycamptothecin liposome(LHCPT) combined with cisplatin(DDP) on cell cycle and apoptosis of DDP-resistanted human esophageal carcinoma cell Eca109(Eca109/DDP).Methods:Eca109/DDP cells were treated with 0,1 mg/L DDP,and then treated with 0.00,0.49,0.98,1.96,3.92,7.84 μg/L LHCPT for 72 h, respectively;MTT method was applicated to detect the cell proliferation.Eca109/DDP cells were treated with 0,1 mg/L DDP,and then treated with 0.00,3.92 μg/L LHCPT for 72 h, respectively;flow cytometry was used to study the cell cycle and apoptosis.Results:Compared with single drug treatment, the growth inhibition effect on Eca109/DDP cells in LHCPT+DDP group was significant(FLHCPT=40.330，FDDP=641.010，Finteraction=20.330，P<0.001),especially 3.92 μg/L LHCPT+1 mg/L DDP.Compared with single drug treatment, 3.92 μg/L LHCPT+1 mg/L DDP could significantly block Eca109/DDP cells at G0/G1phase(FLHCPT=16.184，FDDP=33.660，Finteraction=15.100，P<0.05), and increase the early apoptotic rate，late apoptotic rate and total apoptotic rate(P<0.05).Conclusion: LHCPT has the potential to be an adjunct to chemotherapy for esophageal carcinoma.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.002

*江苏省卫生职业教育研究指导性项目 JZ200911;淮安市科技支撑计划项目 HAS2009002-5

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