慢性阻塞性肺疾病中MMP-9/TIMP-1与Th17/Treg作用与联系

康彩云 吴世满 刘晓君 刘 娟

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种慢性呼吸系统疾病，是慢性支气管炎和肺气肿患者出现肺功能检查气流受限、不完全可逆时的一种疾病。COPD是可以预防和可以治疗的常见疾病[1]。COPD的发病机制复杂多样，具体机制仍未清楚，缺乏有效的防治方法，因而发病率及病死率均较高。研究发现除了一些公认的发病机制外，自体免疫与COPD发病也存在较为密切的关系[2]。COPD再也不能被认为是一种只涉及肺的疾病，系统性炎症反应的后果使它成为其他慢性并发症的重要危险因素[3]。本研究选取COPD急性加重期、COPD稳定期作为研究对象，健康吸烟肺功能正常，健康非吸烟肺功能正常者为对照组，分别抽血外周静脉血，提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，用流式细胞仪检测各组Th17、Treg细胞分化水平，对各组间Th17、Treg分化水平进行比较，用酶联免疫吸附法测定血浆中MMP-9和其抑制物TIMP-1含量，比较各组间MMP9、TIMP-1含量差异，并对MMP-9、TIMP-1含量与Th17、Treg分化水平相关性进行分析，旨在了解MMP-9/TIMP-1与Th17/Treg细胞在COPD自体免疫中的作用机制及其相互联系。

资料和方法

一、研究资料

1. 研究对象： 搜集2013年3月至2013年12月来山西医科大学第一医院呼吸内科就诊的慢性阻塞性肺疾病患者55例，均符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组编写的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)》诊断标准[1]。其中COPD急性加重期患者30例，男22例，女8例，年龄50岁～73岁，平均年龄64.00岁；COPD稳定期25例，男19例，女6例，年龄46～75岁，平均年龄61.26岁。所有患者除外支气管哮喘、支气管扩张、肺间质纤维化、冠状动脉性心脏病、风湿免疫性疾病及其他自身免疫性疾病病史。 肺功能正常组40例，为同期我院门诊健康体检者。健康吸烟肺功能正常组20例，男14例，女6例，年龄46～75岁，平均年龄59.25岁；健康非吸烟肺功能正常组20例，男13例，女7例，年龄46～75岁，平均年龄62.90岁。吸烟者为大于或等于10包/年。所有研究对象均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

2. 主要试剂及仪器： 混合单克隆抗体R-PE IL-17A、Alexa Fluor 647 Foxp3、FITC CD4，刺激剂、细胞固定液、细胞破膜液均购自美国Becton Dickinson公司。人基质金属蛋白酶9 ELISA 试剂盒、人基质金属蛋白酶抑制因子-1 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物公司。 流式细胞分析仪(美国Becton Dickinson公司)，CO2培养箱(美国NAPCO公司)，超净工作台(苏州安泰)，酶标仪(美国宝特800)

二、研究方法

1. 搜集血浆和分离单个核细胞悬液： 全部研究者均于清晨留取空腹静脉血5 ml，置于肝素钠抗凝管中，以离心半径8 cm，2000 r/min，离心10 min，取血浆分装于EP管中-80 ℃冻存。取血浆后的血细胞用磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)重悬，在离心管中加入3 ml淋巴细胞分离液，重悬血细胞加入淋巴细胞分离液上层，以离心半径8 cm，2500 r/min，离心20 min，分离后吸取单个核细胞层于另一离心管中，用PBS洗涤一次，即可得到单个核细胞悬液。

2. 流式细胞术检测Th17、CD4+Treg细胞： 制备得到单个核细胞悬液置于24孔培养板，加入1 ml 1640培养基和2 μl刺激剂在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育4～6 h，按照试剂盒说明加入抗体，经流式细胞仪检测。

3. 血浆MMP9、TIMP-1 的测定： 采用酶联免疫吸附法测定血浆中MMP9、TIMP-1的含量，按照试剂盒说明书操作，用酶标仪450 nm测定OD值。

三、统计学方法

结 果

一、一般情况

各组性别、年龄比例比较差异无统计学意义(χ2=0.736，P>0.05；F=1.215，P>0.05。肺功能指标比较：COPD急性加重期组存在明显气流受限，与健康吸烟组和健康不吸烟组比较，FEV1% pred、FEV1/FVC差异有统计学意义(P<0.05)；与COPD缓解期组相比差异无统计学意义，但急性期组气流受限更明显；COPD缓解期与健康吸烟组和健康不吸烟组比较，FEV1% pred、FEV1/FVC差异有统计学意义(P<0.05);健康吸烟组与健康不吸烟组相比，差异无统计学意义，但健康吸烟组FEV1/FVC、FEV1%pred较不吸烟肺功能正常组有所下降，见表1。

二、各组外周血Th17、Treg细胞占CD4+细胞的比例和Th17/Treg的比值的比较

外周血Th17/CD4+T(%)比较：COPD急性期组高于缓解组、健康非吸烟组、健康吸烟组(F=22.264，P<0.05)；COPD缓解期组与健康吸烟组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与健康非吸烟组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；健康吸烟组与健康非吸烟组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

外周血Treg/CD4+T(%)比较：各组差异无统计学意义(F=1.971，P>0.05)。

表2 各组外周血Th17、Treg细胞占CD4+T细胞的比例和Th17/Treg的比值比较

Th17/Treg比值的比较：COPD急性加重期组显著高于COPD缓解期组、健康吸烟组、健康非吸烟组(F=15.029,P<0.05)；COPD缓解期组与健康吸烟组、健康非吸烟组比较差异无统计学意义(P>0.05)；健康吸烟组与健康非吸烟组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

三、各组血浆MMP-9、TIMP-1 浓度、MMP-9/TIMP-1比值的比较

1. 血浆中MMP-9含量的比较：COPD急性加重期组显著高于COPD缓解期组、健康吸烟组、健康非吸烟组(F=171.545，P<0.01)；COPD缓解期组与健康吸烟组、健康非吸烟组比较，差异有统计学意义(P<0.05),健康吸烟组与健康非吸烟组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2. 血浆中TIMP-1含量的比较：COPD急性加重期组含量显著高于其他三组(F=5.420，P<0.05)；COPD缓解期组与健康吸烟组、健康非吸烟组比较，差异有统计学意义(P>0.05)；健康吸烟组与健康非吸烟组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，但健康吸烟组比较相对略高。

表1 研究对象的一般情况

3. 血浆中MMP-9/TIMP-1比值的比较：各组相比，整体差异有统计学意义，(F=15.029，P<0.01),COPD急性加重期组与其他三组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)；COPD缓解期组与健康组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；健康吸烟组与健康非吸烟组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，但健康吸烟组其比值相对较高，见表3。

表3 各组血浆中MMP-9、TIMP-1含量和MMP-9/TIMP-1的比值比较

四、各组MMP9、TIMP-1/MMP-9/TIMP-1与Th17/CD4+ T(%)、Treg/CD4+ T(%)、Th17/Treg相关性

COPD急性加重期组、COPD缓解期组MMP-9与Th17/CD4+T(%)存在相关性(r值0.376，P<0.05/r值0.459，P<0.05)。健康吸烟组和健康非吸烟组均无相关性。TIMP-1与Treg/CD4+T(%)之间，MMP-9/TIMP-1比值与Th17/Treg比值之间，MMP-9与Th17/Treg比值间，在各组均无相关性。

讨 论

近年来研究发现COPD发生机制是多种因素共同作用的结果，其中MMP-9和TIMP-1平衡失调即MMP-9/TIMP-1比值的变化在COPD发病机制中发挥重要作用[4]。研究发现Th17和Treg平衡失调在COPD的发生发展有重要作用[5-6]。本研究对这两种发病机制的特点及相关关系进行了研究。

MMP-9是细胞外基质降解的主要蛋白酶，主要通过金属锌或钙离子介导引起肺泡壁细胞外基质和基底膜的损伤和降解，破坏正常的肺泡结构，引起肺泡腔的扩大，参与气道重构而导致气道阻塞。TIMP-1是MMP-9的天然抑制因子，主要通过抑制MMP-9活性，在肺泡壁细胞外基质和基底膜的修复过程中发挥重要作用[7]。本研究中COPD急性期组MMP-9含量、TIMP-1含量及MMP-9/TIMP-1比值均明显增高，提示其参与了COPD急性期肺组织进一步损伤，使患者局部和全身炎症反应加重，表现为咳嗽、咳痰症状加重及呼吸困难明显、全身乏力、心律失常、电解质紊乱等并发症。COPD稳定期组与健康组对比MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值亦有所增高，所以稳定期患者也存在长期慢性咳嗽、咳痰症状及活动后气短症状。另外，MMP-9、TIMP-1含量及TIMP-1比值较健康组增高，提示其可能也参与了肺结构的慢性破坏和重塑，并使气道杯状细胞的增生、化生和黏液增加，导致气道慢性炎症和肺气肿，使肺功能指标逐年下降，引起长期的慢性咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状。正常情况下肺组织不表达或仅表达微量的MMP-9，但在各种刺激下，肺的实质细胞如支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞和肺的各种炎性细胞如中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞、肥大细胞及自然杀伤细胞与树突状细胞等均能产生MMP-9[8-9]。健康吸烟者由于长期烟草烟雾的刺激，其MMP-9、TIMP-1含量有所增加，可能长期存在气道损伤和重塑，所以吸烟是慢性阻塞性肺疾病的重要危险因素。

本研究发现COPD急性加重期与缓解期组、健康吸烟、健康不吸烟组比较，Th17占CD4+T淋巴细胞比例增高，差异有统计学意义，Treg与其他各组差异无统计学意义，但较健康对照组有所增加。Th17/Treg比值较缓解期组、健康对照组增高，存在平衡失调。COPD缓解期组Th17、Treg均增高，但是Thl7/Treg尚处于平衡状态。健康吸烟组Th17比例已有所增高，可能由于烟草烟雾及香烟有害物能损伤气道，释放自身抗原物质激发自体免疫反应。Th17细胞是新发现的辅助性T细胞，因其特异性的分泌IL-17而得名。Thl7细胞在肺内高表达可能是导致烟草烟雾暴露小鼠肺内慢性炎症反应持续的原因之一，戒烟是能够延缓COPD患者肺功能进行性下降的有效措施之一[10]。Treg细胞是一群具有调节机体免疫反应的淋巴细胞，是重要的免疫调节细胞，能保持免疫系统的稳定，避免不必要的、过度的免疫应答，具有明显的抗炎和自身免疫调节作用。Th17与Treg细胞类似于Thl与Th2之间的平衡，两者功能相互拮抗，两者之间平衡维持或破坏对于免疫稳定或炎症性疾病的发病具有重要意义。

本研究中亦发现在COPD急性期和缓解期患者，其血浆MMP-9增高时Th17细胞表达也增高，两者存在一定相关性。其机制可能为COPD患者由于多种炎症介质刺激Th17细胞高表达，其分泌IL-17增高，通过募集过多炎症细胞如中性粒细胞和巨噬细胞到达炎症部位，释放更多的MMP-9、弹性蛋白酶等[11]，从而进一步造成肺组织损伤、基质损伤释放弹性蛋白片段，而弹性蛋白片段作为自身抗原激活自体免疫反应，刺激组织炎症反应加重，释放更多炎症介质，形成“瀑布效应”。另外在各种感染、化学性刺激物、烟草烟雾等刺激下，肺的实质细胞如支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞和肺的各种炎性细胞如中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞、肥大细胞及自然杀伤细胞与树突状细胞等均能产生MMP-9，可能MMP-9也会通过IL-6、TGF-β影响CD4+T细胞分化，使Th17表达增高，使Treg表达下降。Sylvester等[12]研究发现，IL-l7能通过NF-kB信号转导通路诱导牛软骨细胞表达引起MMP-9的表达增高，在人体内是否存在IL-17通过其通路使支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及内皮细胞和肺的各种炎性细胞如中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞、肥大细胞及自然杀伤细胞与树突状细胞等释放MMP-9增高，尚需进一步研究。

综上，MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17细胞、Th17/Treg在COPD急性加重期组明显增高，在COPD缓解期组MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17细胞与健康组比较增高明显，所以COPD患者可能存在自体免疫介导的慢性炎症反应，通过免疫调节剂的治疗，有望阻断自体免疫反应，进而缓解和控制COPD的进展。健康吸烟组MMP-9、MMP-9/TIMP-1、Th17、Th17/Treg均较健康非吸烟组升高。所以吸烟容易促发炎症反应，戒烟对防治慢性阻塞性肺疾病是非常重要的。另外在COPD组，MMP-9与Th17占CD4+T比例呈正相关，其确切机制有待进一步研究，这可能也将为慢性阻塞性肺疾病寻找到一个新的治疗靶点。

参 考 文 献

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4 赵 华, 赵 瑾, 许西琳. COPD大鼠模型气道MMP-9和TIMP-1表达的研究[J]. 现代生物医学进展, 2010, 10(12): 2244-2246.

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10 唐海娟, 钟小宁, 段敏超, 等.烟草烟雾暴露对小鼠肺部CD4+白细胞介素一17+T细胞表达的影响[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2012, 35(5): 369-371.

11 Chen Y, Thai P, Zhao YH, et al. Stimulation of airway mucin gene expression by interleukin (IL)-17 through IL-6 paracrine/autocrine loop [J]. J Biol Chem, 2003, 278(19) : 17036-17043.

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