膜分离赣南黑灵芝多糖的研究

★ 杨婕 徐桂香 黄多希 卢艺 许向群

(江西中医药大学 江西 南昌 330004)

灵芝是一种保健和药用价值很高的大型真菌，而黑灵芝被称为灵芝中的极品，对人体保健功效，远比其它种类的灵芝高。灵芝多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用，还可作为肿瘤化疗和放疗的辅助治疗。

膜分离技术具有操作简单、节能、无污染，可在常温下连续操作等优点,特别适用于热敏性物质的分离纯化,该技术在化工、食品、生物、制药等领域得到越来越广泛的关注和应用。本课题组以江西赣南出产的黑灵芝为研究对象，利用灵芝多糖与其他成分分子量差异先采用微滤膜对灵芝浸提液进行除杂，然后采用超滤技术，对灵芝水提物进行分离，分离出不同分子量的灵芝多糖，为后期考察不同分子量段灵芝多糖的免疫增强活性，选择纯化具有免疫活性的灵芝多糖组分，以及灵芝多糖保健食品开发提供理论基础，也为膜分离技术应用于赣南黑灵芝多糖分离纯化的产业化提供参考。

1 实验材料

1.1 实验药材 赣南黑灵芝(采自江西赣南地区)。

1.2 实验试剂 葡萄糖(西陇化工股份有限公司)、氢氧化钠(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)、重蒸苯酚(上海恒远生物科技有限公司)、浓硫酸(东莞市双德化工有限公司)，均为分析纯。

1.3 仪器设备 HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；BS214分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-ⅢB(浙江临江市精工真空设备厂)；RE-5233型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV9100A紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱、Megafugel.OR型高速大容量离心机(德国Thermo公司)；Millipore超滤仪；DZF-6050型真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

2 实验方法和结果

2.1 赣南黑灵芝多糖的提取

2.1.1 赣南黑灵芝饮片的前处理 将赣南黑灵芝饮片洗净，置洁净托盘中铺匀后放入电热恒温鼓风干燥箱中在50℃的条件下干燥，待赣南黑灵芝饮片干燥至用手轻轻碾碎时即取出；再采用高速粉碎机对灵芝进行破碎，并过60目筛。

2.1.2 赣南黑灵芝多糖的提取[2]热水提取多糖时间1 h比较合适，时间太长，可能引起糖结构的变化和破坏，甚至使其中的五碳环或六碳环裂解，导致多糖的含量下降。热水浸提的温度也不宜过高，过高有可能破坏多糖的结构。称取适量灵芝粉末，然后加15倍质量的水，在温度90℃的条件下浸提2h。

2.2 赣南黑灵芝多糖的微滤膜除杂 将赣南黑灵芝多糖粗提取液用离心机在4000r/min，25℃条件下离心15min，取上清液。灵芝水提液中除了含有灵芝多糖外，还含有大分子的蛋白质和一些杂质，故选用微滤膜将灵芝水提液中的杂质及大分子的蛋白质除去。我们选用无机微滤膜N100和N30两种不同型号的微滤膜对灵芝水提液进行除杂，比较其效果，选择更合适的一种。其工作条件为：进口压力0.26MPa，出口压力0.14MPa、操作温度60℃，流量为90L/min。灵芝多糖的测定采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。

杂质截留率采用公式：R=(1-Cp/Ci)×100%

式中：R为杂质截留率；Cp为透过液中杂质的浓度，(mg/L)；Ci为原液中杂质的浓度，(mg/L)。

表1 微滤膜N100与N30的除杂效果表

用微滤膜进行除杂试验时，每10 min测1次膜的通量。纳滤膜N100与N30的通量衰减曲线见图1。结果显示，微滤膜N30和微滤膜N100除杂效果差别不大，除杂后固含物的差别也不大，但是微滤膜N100要高于N30的平均通量，从经济和效率角度考虑，选择微滤膜N100更合适。

图1 纳滤膜N100与N30的通量衰减曲线

2.3 赣南黑灵芝多糖不同分子量段的超滤分离 组成灵芝多糖的单糖类型以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖为主，还有少量岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、海藻糖等，少数多糖由单一葡萄糖组成。控制超滤压力为0.08MPa，分别用分子截流量为100，30，10ku的超滤膜，将粗提物按分子量大

小分为>100ku(AGP1)、30～100ku(AGP2)、10～30ku(AGP3)和<10ku(AGP4)四部分，冷冻干燥，称重，计算得率。

各分子量段多糖所占的百分比按下式计算:ω(%)=W1/W0×100。式中:W1为各分子量段多糖的质量;W0为四部分多糖的质量之和。

总糖含量测定：采用苯酚-硫酸法测定AGP1～AGP4中的总糖含量，结果见表2。结果显示在四段多糖中，分子量>100ku的部分(AGP1)所占比例最高，为41.66%，分子量为10～30ku的部分(AGP3)所占比例最低，约为1.04%，分子量为10～30ku的部分(AGP2)和分子量<10ku的部分(AGP4)所占比例分别为20.13%和27.72%。各分子量段多糖的总糖含量存在一定差异，AGP1的总糖含量最高，为52.77%，AGP4的总糖含量最低，为41.03%。

表2 各分子段多糖得率及总糖含量

4 结论

超滤技术作为一项新兴的高效分离技术，是一个物理处理过程，具有操作简单，能耗少，工序简捷的特点，采用超滤分离得到四个不同分子量段的赣南黑灵芝多糖组分，总糖含量及单糖组成分析表明四者总糖含量存在一定差异。相关结果可为灵芝多糖类保健食品的工业开发提供理论支撑。

[1]高续春.多糖提取纯化方法研究进展[J].榆林学院学报，2009，19(4):65-67.

[2]张洪杰，王广乐.赣南黑灵芝中多糖提取工艺的研究[J].江苏科技大学学报(自然科学版)，2013，27(1)：80-84.

[3]董艳.膜分离提取纯化中药多糖的工艺研究[D].天津：天津大学,2007.

[4]杨勇杰，姜瑞芝，陈英红，等.苯酚-硫酸法测定杂多糖含量的研究[J].中成药，2005,27(6)：706-708.

[5]张庆雷，周宏兵.膜分离技术及其在多糖分离纯化研究中的应用[J].食品与药品，2009,11(5)：60-62.

[6]王湛.膜分离技术基础[M].北京：化学工业出版社，2006.