VEGF—C表达及D2—40标记的微淋巴管密度与宫颈癌淋巴道转移的关系

钟守军等

[摘要] 目的 探讨血管内皮生长因子C（VEGF-C）表达和D2-40标记的微淋巴管密度（MLVD）与宫颈癌淋巴道转移的关系。方法 应用全自动多功能组织病理检测系统检测80例宫颈癌组织中VEGF-C及D2-40表达，对D2-40阳性脉管进行MLVD计数。结果 宫颈癌组织中VEGF-C表达明显增高（49/80），而正常宫颈黏膜组织中未见VEGF-C表达；宫颈癌有淋巴结转移组（20/26）VEGF-C表达水平较无转移组（29/54）增高。宫颈癌组织中MLVD较正常黏膜组织增高；有淋巴结转移组MLVD高于无转移组，且宫颈癌组织中VEGF-C表达与MLVD呈正相关。结论 VEGF-C在宫颈癌组织中表达增高及MLVD计数增高与宫颈癌浸润、淋巴道转移等生物学行为密切相关，可作为评估宫颈癌预后的重要生物学指标；VEGF-C可能促进淋巴管新生。

[关键词] VEGF-C；微淋巴管密度；宫颈癌；淋巴道转移

[中图分类号] R739.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）22-0074-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship of the expression of VEGF-C and MLVD with lymphatic metastasis in cervical carcinoma. Methods The immunohistochemistry expressions of VEGF-C and D2-40 were detected by the automatic multifunctional pathology detection system in 80 cases invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix. The MLVD was assayed by D2-40 positive vascular count. Results Expression of VEGF-C was significantly higher levels in cervical carcinoma（49/80）， and there was no expression in normal cervical mucosal tissues. VEGF-C expression in cervical carcinoma with lymph node metastasis （20/26） was significantly higher than those without lymph node matastasis（29/54）. MLVD in cervical carcinoma was significantly higher than those in normal tissues， and MLVD in cervical carcinoma with lymph node metastasis was significantly higher than those without lymph node matastasis. The VEGF-C expression was positively correlated with MLVD in cervical carcinoma. Conclusion The overexpression of VEGF-C and high MLVD are significantly correlated with cervical carcinoma progression and lymph node metastasis， which can be used as an important biological indicate to evaluate the prognosis of cervical cancer； VEGF-C may promote lymphangiogenesis.

[Key words] VEGF-C； MLVD； Cervical carcinoma； Lymphatic metastasis

宫颈癌是妇科常见而重要的生殖道恶性肿瘤，除直接蔓延外，淋巴道转移是其最重要和最常见的播散途径，也是决定患者生存及预后的重要因素之一，所以对有关宫颈癌淋巴道转移机制的研究具有非常重要的现实意义。既往由于缺乏淋巴管内皮细胞特异性的标志物，是以肿瘤淋巴道转移机制的研究进展相对滞后，而且有关淋巴管与肿瘤间关系的研究尚存在一些矛盾的结果。D2-40 是新近发现的一种特异性淋巴管内皮细胞标志物，具有较高的特异性和敏感性[1]。血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是一种能特异性诱导淋巴管内皮细胞增殖、趋化的重要因子，研究表明其表达水平与肿瘤的淋巴道转移密切相关[2]。本研究采用全自动多功能组织病理检测系统检测宫颈癌组织中VEGF-C及D2-40的表达，并观察计数肿瘤微淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD），以探讨VEGF-C及MLVD与宫颈癌微淋巴管生成及淋巴道转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

80例宫颈鳞癌组织石蜡标本均来自我院病理科2008年1月～2012年12月间存档蜡块。所有病例均实施宫颈癌根治术和盆腔淋巴结清扫，全部患者术前均未接受过放疗或化疗，临床资料完整，均经病理组织学确诊。患者年龄29～70岁，平均51.6岁，其中有盆腔淋巴结转移26例，无盆腔淋巴结转移54例，且根据国际抗癌联盟规定，每例剥离的淋巴结数目均不少于10枚。另取20例同期手术切除子宫之正常宫颈组织作为对照组。endprint

1.2 方法

所有组织学标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。应用全自动多功能组织病理检测系统（BenchMark XT，美国罗氏）进行免疫组织化学染色。SSC清洗缓冲液、DAB显色液等均购自上海罗氏公司。一抗VEGF-C兔抗人多克隆抗体、D2-40兔抗人单克隆抗体均为上海长嘉生物科技有限公司产品。采用已知的宫颈鳞癌组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判读

VEGF-C阳性染色定位于肿瘤细胞胞质，呈淡黄色或棕黄色颗粒样着色。根据染色阳性细胞的数量及其染色强度分为三级[3]：阳性细胞数>60%，多数细胞呈棕黄色至黄色染色，为强阳性表达（3+）；阳性细胞数<10%，染色强度为淡黄色或仅个别细胞呈棕黄色至黄色染色，为弱阳性表达（1+）；阳性细胞数及染色强度介于强阳性与弱阳性之间者，为中度阳性表达（2+）。凡免疫组化染色强度与背景无明显差别者均判读为阴性（-）。

D2-40阳性染色呈棕黄色颗粒样着色，定位于淋巴管内皮细胞胞质。肿瘤MLVD的判定及计数方法[1]：根据D2-40在组织切片中的染色情况，以阳性染色的内皮细胞簇或单个内皮细胞分别计为一个阳性微淋巴管。首先在低倍镜下（×40）选定染色密集的5个区域，然后在高倍镜下（×200）分别计数所选定的5个视野中被染色的微淋巴管数目，取其平均值作为该例的MLVD。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析；计数资料比较采用χ2检验（Fisher确切概率法）；应用Spearman等级相关分析VEGF-C表达与MLVD的相关性；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF-C在宫颈鳞癌中的表达

VEGF-C阳性表达呈淡黄色或棕黄色，主要定位于肿瘤细胞胞质，偶见于脉管内皮细胞或间质细胞（图1）。宫颈鳞癌组织中VEGF-C表达阳性率约为61.25%（49/80），而20例正常宫颈黏膜组织中均未见VEGF-C表达，且宫颈鳞癌有淋巴结转移组（20/26）VEGF-C表达水平较无淋巴结转移组（29/54）增高，三组间比较差异有统计学意义（χ2=27.806，P=0.000）。两两比较（矫正α为0.05/3），正常宫颈组织分别与无淋巴结转移组、有淋巴结转移组之间比较差异有统计学意义（χ2=17.424、26.627，P=0.000）（Fisher确切概率法）；无淋巴结转移组与有淋巴结转移组之间比较差异有统计学意义（χ2=3.987，P=0.046）。见表1。

2.2 D2-40标记的微淋巴管形态学特点及MLVD计数

D2-40阳性染色定位于淋巴管内皮细胞胞质，呈棕黄色或黄色颗粒样着色。正常宫颈黏膜组织中D2-40染色阳性的淋巴管数目较少，形态多较规则，分布较均匀，新生微淋巴管较少见；而宫颈鳞癌组织中D2-40染色阳性微淋巴管分布明显增多而不规则（图2），一般位于癌巢周边区域，尤其在癌巢浸润前缘，多呈扩张状态，形态不甚规则，大小不一，管壁较薄且无平滑肌组织，基底膜多不完整，腔内偶见淋巴细胞；也有的微淋巴管为几个内皮细胞组成的细胞簇或呈闭锁的条索样，有的甚至仅为单个内皮细胞；个别微淋巴管内可见癌栓（图3）。正常宫颈黏膜组织、宫颈鳞癌无淋巴结转移组和有淋巴结转移组MLVD计数分别为（2.42±0.64）、（6.73±0.91）、（9.87±1.02），经单因素方差分析，三组之间比较差异有统计学意义（F=397.226，P=0.000）。经Newman-Keuls法两两比较，各组间差异均有统计学意义（q=26.198、39.853、20.929，P<0.01）。见表1。

2.3 VEGF-C表达与MLVD相关性

采用Spearman等级相关分析表明，宫颈鳞癌组织VEGF-C表达与MLVD之间存在正相关（r=0.556，P<0.01）。

3 讨论

宫颈癌是女性常见而重要的生殖道恶性肿瘤，除直接蔓延外，淋巴道转移是其最重要和最常见的播散途径，也是决定患者生存及预后的重要因素之一，是以有关宫颈癌淋巴道转移机制的研究具有非常重要的现实意义。既往由于缺乏特异性的淋巴管内皮细胞标记物，因此有关肿瘤淋巴道转移机制的研究相对滞后，而且有关淋巴管与肿瘤之间关系的研究中尚存在一些矛盾的结果。

D2-40 是新近发现的一种特异性的淋巴管内皮细胞标志物，它不与血管内皮细胞反应，而是与淋巴管内皮细胞特异性地结合反应，是目前较为理想的淋巴管内皮细胞标志物，并已经开始应用于肿瘤淋巴管与肿瘤生物学关系的研究[4]。肿瘤细胞所处的微环境状态，对于肿瘤细胞的生长、增殖以及侵袭、转移起着重要的作用，而MLVD计数可以一定程度地反映肿瘤细胞所处的微环境状态。随着肿瘤细胞的克隆性增殖，肿瘤体积不断增大，其诱导产生的微淋巴管数亦可不同程度增加，同时由于组织间隙水肿，导致肿瘤微淋巴管的开放或扩张，从而有利于肿瘤细胞侵入淋巴道而进一步转移扩散。Takanami[1]研究认为，以D2-40标记的MLVD计数是肿瘤淋巴道转移的一个独立预测因子。本组实验中发现宫颈鳞癌组织MLVD为（7.75±1.63），明显高于正常宫颈组（2.42±0.64）；且有淋巴结转移组MLVD为（9.87±1.02），高于无淋巴结转移组（6.73±0.91），三组之间差异均有统计学意义。同时，实验中还发现肿瘤微淋巴管多位于癌巢周围，尤其是浸润的前缘部位，MLVD计数明显增多，且绝大多数微淋巴管形态不规则，部分扩张明显，少数呈闭塞状态，表明在肿瘤发生淋巴道转移的过程中，肿瘤周围组织中的微淋巴管发挥了重要的作用，与既往研究结果相一致[5，6]。

VEGF-C又被称为淋巴管内皮生长因子，是VEGF家族的新成员。其主要功能是通过与表达于淋巴管内皮细胞的VEGFR-3受体特异性结合，激活受体酪氨酸激酶信号系统，进一步诱导肿瘤形成新的淋巴管（淋巴管新生），并能促进肿瘤细胞进入微淋巴管，通过淋巴系统向全身扩散和转移[7]。研究认为VEGF-C是恶性肿瘤一个独立的预后因素，其过表达不仅可以促进肿瘤细胞的增殖，还可诱导肿瘤微淋巴管生成，并促进肿瘤细胞在淋巴管内的播散。在多种人体肿瘤组织的研究中发现VEGF-C过表达与肿瘤的淋巴道转移呈正相关[8]。本组研究显示宫颈鳞癌组织中VEGF-C表达阳性率约为61.25%（49/80），而在正常宫颈组织中均未见VEGF-C表达，且宫颈癌有淋巴结转移组（20/26）VEGF-C表达水平较无转移组（29/54）增高，三组间差异均有统计学意义，表明宫颈癌细胞可以产生VEGF-C使之表达升高，并可能与宫颈癌的发生、发展及浸润、转移等生物学行为密切相关，可作为评估宫颈癌预后的重要生物学指标之一。endprint

采用Spearman相关分析表明，宫颈癌组织中VEGF-C表达水平与MLVD计数之间存在正相关，提示VEGF-C可以诱导肿瘤淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成，并且与肿瘤的淋巴道转移密切相关。推测肿瘤细胞可能通过产生VEGF-C并与其受体特异性结合，从而诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管新生和扩张；而肿瘤MLVD计数增加为肿瘤细胞进一步侵入微淋巴管提供了更有利的条件，从而促进肿瘤细胞的淋巴道转移[9]。

总之，虽然有关宫颈癌淋巴道转移的具体机制尚不完全清楚，但肿瘤的淋巴道转移无疑是一个涉及到多个因素的多步骤、多阶段的复杂过程。在肿瘤的淋巴道转移过程中，瘤细胞产生的VEGF-C可能发挥了重要作用。VEGF-C可通过与其特异性的受体结合诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成，并进一步促进肿瘤细胞的淋巴道扩散和转移，因此，临床检测VEGF-C表达及MLVD计数可作为评估肿瘤细胞诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成研究的重要指标，并有助于临床对宫颈癌治疗方案的评价及预后判断。

[参考文献]

[1] Takanami E. Lymphatic microvessel density using D2-40 is associated with nodal metastasis in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep，2006，15（2）：437-442.

[2] 任彦武，高峰. VEGF-C、Podoplanin与肿瘤淋巴管生成及转移关系的研究进展[J]. 癌症进展，2013，11（2）：155-158.

[3] 盛薇，王虎霞，王光辉，等. 乳腺癌VEGF-C的表达与淋巴管生成的相关性[J]. 西安交通大学学报（医学版），2008，29（6）：679-682.

[4] Saptefrait L，Cǐmpean AM，Ciornǐi A，et al. Identification of lymphatic vessels and prognostic value of lymphatic microvessel density in lesions of the uterine cervix[J]. Rom J Morphol Embryol，2009，50（4）：589-594.

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[6] Gombos Z，Xu X，Chu CS，et al. Peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor C expression in early-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Clin Cancer Res，2005，11（23）：8364-8371.

[7] Watanabe S，Kato M，Kotani I，et al. Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Squamous Cell Carcinomas of Lip and Oral Cavity：A Clinicopathological Analysis with Immunohistochemistry Using Antibodies to D2-40，VEGF-C and VEGF-D[J]. Yonago Acta Med，2013，56（1）：29-37.

[8] Botting SK，Fouad H，Elwell K，et al. Prognostic significance of peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor receptor 3 in invasive squamous cell cervical cancer[J]. Transl Oncol，2010，3（3）：170-175.

[9] Sotiropoulou N，Bravou V，Kounelis S，et al. Tumor expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression[J]. Pathology，2010，42（7）：629-636.

（收稿日期：2014-03-18）endprint

采用Spearman相关分析表明，宫颈癌组织中VEGF-C表达水平与MLVD计数之间存在正相关，提示VEGF-C可以诱导肿瘤淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成，并且与肿瘤的淋巴道转移密切相关。推测肿瘤细胞可能通过产生VEGF-C并与其受体特异性结合，从而诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管新生和扩张；而肿瘤MLVD计数增加为肿瘤细胞进一步侵入微淋巴管提供了更有利的条件，从而促进肿瘤细胞的淋巴道转移[9]。

总之，虽然有关宫颈癌淋巴道转移的具体机制尚不完全清楚，但肿瘤的淋巴道转移无疑是一个涉及到多个因素的多步骤、多阶段的复杂过程。在肿瘤的淋巴道转移过程中，瘤细胞产生的VEGF-C可能发挥了重要作用。VEGF-C可通过与其特异性的受体结合诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成，并进一步促进肿瘤细胞的淋巴道扩散和转移，因此，临床检测VEGF-C表达及MLVD计数可作为评估肿瘤细胞诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成研究的重要指标，并有助于临床对宫颈癌治疗方案的评价及预后判断。

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（收稿日期：2014-03-18）endprint

采用Spearman相关分析表明，宫颈癌组织中VEGF-C表达水平与MLVD计数之间存在正相关，提示VEGF-C可以诱导肿瘤淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成，并且与肿瘤的淋巴道转移密切相关。推测肿瘤细胞可能通过产生VEGF-C并与其受体特异性结合，从而诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管新生和扩张；而肿瘤MLVD计数增加为肿瘤细胞进一步侵入微淋巴管提供了更有利的条件，从而促进肿瘤细胞的淋巴道转移[9]。

总之，虽然有关宫颈癌淋巴道转移的具体机制尚不完全清楚，但肿瘤的淋巴道转移无疑是一个涉及到多个因素的多步骤、多阶段的复杂过程。在肿瘤的淋巴道转移过程中，瘤细胞产生的VEGF-C可能发挥了重要作用。VEGF-C可通过与其特异性的受体结合诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成，并进一步促进肿瘤细胞的淋巴道扩散和转移，因此，临床检测VEGF-C表达及MLVD计数可作为评估肿瘤细胞诱导淋巴管内皮细胞增殖及微淋巴管形成研究的重要指标，并有助于临床对宫颈癌治疗方案的评价及预后判断。

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[7] Watanabe S，Kato M，Kotani I，et al. Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Squamous Cell Carcinomas of Lip and Oral Cavity：A Clinicopathological Analysis with Immunohistochemistry Using Antibodies to D2-40，VEGF-C and VEGF-D[J]. Yonago Acta Med，2013，56（1）：29-37.

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[9] Sotiropoulou N，Bravou V，Kounelis S，et al. Tumor expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression[J]. Pathology，2010，42（7）：629-636.

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