HBoV VP1-U蛋白抗原的表达纯化

漆正宇，龚英浩

(1. 北京大学深圳医院 中心实验室，广东 深圳518036；2.病毒基因工程国家重点实验室，北京100052；3.贵州大学 生命科学院，贵州 贵阳550025)

人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)为2005年首次报道的一种感染人呼吸道的细小病毒[1]，是人支气管炎的一种病原体[2,3]。细小病毒外观呈球形无包膜的正20面体，直径大约20-25 nm[4]。HBoV基因组为单链DNA，全长大约5.6 kb，主要编码的蛋白有NS1、NP-1、VP1、VP2等[1]。其衣壳蛋白包括VP1和VP2，VP1基因包含5’端的独有区(unique region of VP1，VP1-U)序列和3’端的VP2序列，是一个典型的重叠基因[1]。一般而言，细小病毒VP2是占病毒衣壳95%的主要蛋白，而VP1蛋白N端的VP1-U在病毒感染入胞中有重要意义[5]。本研究表达纯化有活性的HBoV VP1-U蛋白抗原，为临床免疫诊断方法的建立及蛋白功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 PMSF溶液 PMSF粉末0.174 g溶解于10 ml异丙醇，1.5 mlEP管分装，-4℃保存。

1.1.2 蛋白纯化溶液体系 10×buffer 1：Tris碱粉末1.21 g溶解于50 ml H2O中，然后加入NaCl 14.61 g，加H2O到95 ml体积，滴加0.1 M HCl调节pH=7.9，补充H2O至总体积为100 ml。5×buffer 2：Tris 0.61 g溶于50 ml H2O，再加入NaCl 14.61 g和C3H4N213.62 g，加H2O至95 ml，0.1 M HCl调节pH=7.9，补加H2O到总体积为100 ml。buffer A： buffer 1中加入至CH5N3·HCl，CH5N3·HCl终浓度为6 M。7.5 M的CH5N3·HCl。0.1 M的NiSO4。

1.1.3 菌株和培养基 大肠杆菌BL21(DE3)株为本室保存。细菌增菌培养基为LB液体培养基。LB分选固体平板为LB液体培养基含1.5%琼脂糖，高压灭菌后，添加相应筛选抗生素铺板，室温冷却成固体平板培养基。

1.1.4 各种工具酶和试剂 各种限制性内切酶和Ex-Taq PCR反应体系(Takara)； T4 DNA Ligase连接酶体系(NEB)；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(Geneaid)； DNA提取试剂盒(Qiagen)； pGEM○R-T Easy载体TA克隆试剂盒(Promega)； BCATMProtein Assay Kit蛋白纯化试剂盒(PIERCE)。引物由上海生工公司合成。亲和层析柱HiTrapTM 1 ml Chelating HP(Amersham)。

1.2 方法

1.2.1 VP1-U蛋白抗原性分析 用DNAStar Protean软件分析VP1-U蛋白抗原性，初步了解VP1-U段在VP1中的抗原性强弱。

1.2.2 HBoV VP1-U密码子改造 HBoV VP1-U DNA序列在大肠杆菌中表达的会有一些大肠杆菌不偏爱的稀有密码子，在http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/上在线分析，得到稀有密码子的分布情况。使用Vector NTI 9软件针对大肠杆菌密码子频率初步改造VP1-U DNA，改造后氨基酸序列与原序列一致。

1.2.3 重组表达载体pET30a(+)/VP1-U的构建 采用pET30a(+)为载体在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白。密码子改造好的VP1-U在DNA 5’和3’端分别附带NdeI(CA^TATG)和XhoI(C^TCGAG)限制酶序列，交上海生工公司合成。TA克隆序列后，构建到pET30a(+)载体上，测序鉴定。

1.2.4 VP1-U蛋白表达纯化 制备上柱样品：在含kalamycin的500 ml LB培养基中37℃摇菌至OD600 0.4-1；IPTG 1.5 mM诱导表达2 h(经IPTG梯度浓度和分时抽样确定此最佳条件)；蛋白提取全过程程4℃低温操作，每1 h加入终浓度为1 mM的蛋白酶抑制剂PMSF；离心收集菌液，约20 ml buffer 1洗涤一次；超声破碎后高速离心30 min，弃上清，沉淀用5 ml buffer A重悬，室温放置3 h以充分溶解包涵体；高速离心1 h，上清过0.22 μm滤器成上柱样品。样品上柱纯化顺序：依次5倍柱体积纯水和buffer 1洗柱，2倍柱体积0.1 M NiSO4上柱(上镍)；5倍柱体积buffer 1和buffer A洗柱；上样，buffer A洗样至无峰；20 ml buffer A分多次(5次以上)梯度搀兑buffer 1洗柱，直至洗柱液buffer A经梯度搀兑最终被替换为纯buffer 1，且洗至无峰；buffer 2洗脱，收集峰值洗脱液即为目的蛋白液。超滤换液纯化蛋白：加2 ml洗脱峰液入3 kD截流超滤管，7500×g离心6 h，期间每小时补充一次buffer 1至超滤管液体为2 ml。纯品VP1-U蛋白进行SDS-PAGE不连续电泳，考马斯亮蓝染色后判断纯化结果，并BCA定量。

2 结果

2.1 VP1-U蛋白抗原性分析

DNAStar软件分析结果显示，VP1-U蛋白具有较强的抗原性、亲水性和表面概率。

图1 VP1-U蛋白抗原性分析

2.2 VP1-U DNA改造后的序列

我们检测编码CZ688的HBoV病毒株VP1-U DNA序列按照大肠杆菌密码偏爱优化改造如图2。

图2 VP1-U密码子优化改造后的序列

2.3 VP1-U表达纯化

样品穿过镍柱的吸光度最高峰为105，收集吸光度75～105间急速上升和下降时的洗脱液，超滤换液。纯化过程中各步骤样品检测SDS-PAGE不连续电泳图(图3)，纯化蛋白大小符合VP1-U大小(15.5 kD)。纯化后蛋白终浓度BCA定量为3.3 mg/ml。氨基酸末端测序证实蛋白序列正确。

M：蛋白标准(kD)；1：诱导前；2：诱导后；3：超声破碎上清；4：上清洗脱液；5：包涵体溶解液洗脱峰；6：包涵体溶解液洗脱峰超滤。

3 讨论

HBoV VP1-U原始序列并不适合原核表达，而密码子优化后，获得了理想的表达效果。为使蛋白的纯化相对简便和高效，首选pET30a(+)母载体自带组氨酸标签表达，镍离子亲和层析。HBoV VP1-U活性氨基酸集中在较靠近N端的位置，而其C端所连接的VP2的N端富含甘氨酸且多变，因此采用C端融合表达可能最大限度保证蛋白的抗原性。在pET30a(+)载体中选用NdeI(CA^TATG)和XhoI(C^TCGAG)为限制酶，可以使VP1-U 5’端处于SD序列的理想位置，且3’端融合表达除纯化标签6His外尽可能少。

菌体代谢优先消耗培养基中的葡萄糖，当葡萄糖不足时开始利用乳糖为能源。pET30a(+)/VP1-U超表达时，因葡萄糖已经消耗为不足而质粒通过T7启动子启动乳糖操纵子，乳糖操纵子控制目的基因VP1-U超表达，因此，在培养初期添加适量葡萄糖使得质粒不启动目的基因表达而有利增菌，IPTG诱导时细菌数量足够大即可在短期里获得大量超表达目的蛋白。

许多真核蛋白基因在大肠杆菌中高效表达时，产物以一种无活性的、不溶于水的包涵体形式存在。包涵体除含有重组蛋白聚合物外，还含有核酸和其他杂蛋白。超声裂解菌体和回收包涵体可以去除大部分杂质，但还需要复性和纯化才能得到高纯度的活性蛋白。HBoV VP1-U表达，虽然菌体裂解上清也存在目的蛋白带，但从上清不能纯化来看，似乎是超声裂解时目的蛋白和其他杂蛋白断裂所致，因此，VP1-U主要以包涵体的形式存在。我们采用，在镍离子柱上更换缓冲体系，洗脱的同时得到复性蛋白，大大简化了流程。

螯和亲和层析的关键是上柱样品的置备和缓冲体系的设计。纯化过程中我们发现表达的产物非常容易被蛋白酶降解，包涵体溶解前需要低温操作，并加入蛋白酶抑制剂。保持上柱样品的溶剂体系与洗柱、洗脱体系一致，并且能保持一致，是流程设计中要考虑的关键问题。目的蛋白的功能研究涉及到磷脂酶活性，避免采用磷酸盐缓冲体系。本研究采用自设计的高倍浓度的Tris缓冲体系储存液，工作液随用随搀兑，最大限度保持了缓冲体系的一致，成功得到了活性[6]高浓度蛋白洗脱液。这种梯度搀兑法也是实现边洗脱边复性的基础。

本研究通过包涵体的提取、变性、目的蛋白的纯化和复性等一系列工作，得到了有生物学活性的纯融合蛋白，为HBoV的免疫学检测方法研究和蛋白功能研究提供了技术路线和材料。

参考文献：

[1]Allander T,Tammi MT,Eriksson M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:12891.

[2]Simon A,Groneck P,Kupfer B,et al.Detection of bocavirus DNA in nasopharyngeal aspirates of a child with bronchiolitis[J].J Infect,2007,54(3):e125.

[3]Hirose Y,Hamada H,Wakui T,et al.Characteristic systemic cytokine responses in children with human bocavirus-positive lower respiratory tract infection[J].Microbiol Immunol,2014,58(3):215.

[4]Cotmore S F,Tattersall P.Characterization and molecular cloning of a human parvovirus genome[J].Science.1984,226:1161.

[5]Mavis AM,Michael GR.The Structure of Human Parvovirus B19[A].Anderson LJ,Young NS (eds).Human Parvovirus B19[M].Monogr Virol.1997,vol 20:3-15.

[6]Qu XW,Liu WP,Qi ZY,et al.Phospholipase A2-like activity of human bocavirus VP1 unique region[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,365(1):158.