镍化磁性琼脂糖凝胶微球的制备及其在蛋白纯化中的应用研究

梁媛媛，张海利，杨鲁萍，焦艳华

(1.杭州师范大学材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036；2.杭州师范大学生物医药与健康研究中心，浙江 杭州 311121；3.杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310036)

基于金属鳌合亲和介质的六聚组氨酸融合蛋白纯化方法已经得到了广泛的应用，国外公司已经推出了各种用于纯化六聚组氨酸融合蛋白的产品，但是售价昂贵，国内相应产品较为短缺[1-2].本文拟以自制的磁性琼脂糖凝胶微球为载体，亚氨基乙二胺为鳌合剂制备表面螯合Ni2+的金属鳌合亲和磁性微球，用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化，并与商品化镍鳌合次氨基三乙酸琼脂糖微球(NTA-Ni)的性能进行比较.本研究的开展为了寻求价廉物美的新型蛋白纯化试剂以代替价格昂贵的进口产品，具有重要的现实意义.

1 实验部分

1.1 试剂

氯化铁、氯化亚铁、HCl、NaOH、Tween-20、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4等均为天津大茂化学试剂厂产品(分析纯)；琼脂糖、1,4-二氧六环、环氧氯丙烷、亚氨基乙二酸、氯化镍、咪唑等均为阿拉丁试剂公司产品(分析纯)；NTA-Ni为Qiagen公司产品；六聚组氨酸融合蛋白K8粗菌液由杭州师范大学生物医药与健康研究中心李海峰博士惠赠.

1.2 Fe3O4纳米粒子的制备

称取3.4 g FeCl3·6H2O与1.2 g FeCl2·4H2O溶于800 mL水中，氮气保护下机械搅拌(300 r/min)，水浴加热至60 ℃，滴加40 mL 1.5 mol/L NaOH溶液，反应液由黄色变为黑色，滴加完毕后继续搅拌2 h，再升温至90 ℃，搅拌2 h后停止反应，磁分离合成好的Fe3O4，并用纯水洗涤至pH呈中性，冻干保存备用.

1.3 磁性琼脂糖微球(Mag-Agarose)的制备及活化

称取上述制备的0.6 g Fe3O4投于50 mL水中，均匀分散，再加入3.0 g琼脂糖，摇匀，再微波炉中加热至完全溶解，120 ℃下加入甲苯(140 mL)、四氯化碳(60 mL)和Span 80(10 mL)的混合溶液中，1000 r/min搅拌，冷却至室温.用分液漏斗除去反应液中的油相，然后用磁分离方法除去反应液，最后用乙醇和纯水洗涤多次，然后采用布氏漏斗抽滤除去液相；称取10 g 上述固相产品，投于10 mL纯水之中，搅拌分散均匀，加入1 mL环氧氯丙烷，25 ℃水浴加热30 min，滴加6 mL 5 mol/L的 NaOH溶液，继续搅拌60 min，再升温至60 ℃反应90 min，停止反应后采用布氏漏斗抽滤除去反应液，水洗Mag-Agarose至pH中性，备用.

1.4 Mag-Agarose的环氧化

将上一步得到的产品投入6.5 mL 2 mol/L的NaOH溶液之中，并加入4 mL环氧氯丙烷和15 mL 50%的1,4-二氧六环，于45 ℃恒温摇床中振荡反应24 h，反应结束后，将反应液用布氏漏斗抽滤除去，固相产品水洗至pH中性，获得表面含有环氧基团的磁性琼脂糖凝胶微球Mag-Agarose-Epo.

1.5 环氧化Mag-Agarose的羧酸化

将4 g亚氨基乙二酸在冰浴下投入25 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液中，搅拌至完全溶解，用饱和NaOH溶液调节pH至11.5，再将上一步制好的环氧化磁性凝胶微球投入上述配好的溶液之中，25 ℃水浴下反应过夜.反应液用布氏漏斗抽滤除去，水洗Mag-Agarose至pH中性，获得表面含有羧酸基团的磁性琼脂糖凝胶微球Mag-Agarose-Aci.

1.6 羧酸化Mag-Agarose的镍化

将上一步反应得到的羧酸化磁性琼脂糖微球投入100 mL 0.5 mol/L的氯化镍溶液之中，25 ℃水浴下搅拌48 h，停止反应.反应液用布氏漏斗抽滤，水洗除去残留的氯化镍，最后得到表面含有Ni2+的螯合磁性微球Mag-Agarose-Ni，置于100 mL 30%乙醇溶液中保存备用.

1.7 六聚组氨酸融合蛋白亲和层析纯化

在0.7 g Mag-Agarose-Ni中加入1 mL K8酶粗菌液，4 ℃振荡孵育1 h，磁分离，加入2 mL 裂解缓冲液(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 咪唑, 1% Tween 20,pH 8.0)，振荡15 min，磁分离，再用2 mL 清洗液(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 咪唑, 0.05% Tween 20,pH 8.0)清洗，振荡15 min，磁分离，收集未被吸附的物质W液，最后用2 mL洗脱液(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 咪唑, 0.05% Tween 20, pH 8.0)洗脱4次，磁分离，收集洗脱液E液，并将上述收集到的W液、E液进行SDS-PGMA电泳分析.

纯化容量：取2 mg Mag-Agarose-Ni于离心管中，加入融合蛋白K8的菌体裂解液2 mL孵育15 min，磁性分离，测定上清中蛋白浓度，至上清液中蛋白浓度不再升高磁粒达到饱和为止.用清洗缓冲液洗去未吸附的杂蛋白后采用咪唑洗脱吸附的融合蛋白，通过Bradford法测定洗脱的蛋白含量，并按式(1)对Mag-Agarose-Ni的纯化容量进行计算.

纯化容量(μg/mg)=洗脱液中蛋白含量(μg)/凝胶微球重量(mg)

(1)

2 结果与讨论

2.1 Mag-Agarose-Ni的结构与表征

图1 Mag-Agarose-Ni的制备示意图

图2 磁性琼脂糖凝胶微球(a)、环氧化磁性琼脂糖微球(b)、羧酸化磁性琼脂糖微球(c)以及镍化磁性琼脂糖微球(d)的红外光谱图

表面含有Ni2+的螯合磁性微球Mag-Agarose-Ni的制备过程如图1所示，我们采用红外光谱对各反应步骤中的产物结构进行了表征，结果如图2所示.从图2b中可以看出，经过环氧化处理后，琼脂糖凝胶微球在911、847 cm-1处出现了环氧基团特振吸收峰，进一步经过羧酸化处理后，在图2c中的1 740 cm-1处出现了羰基振动吸收峰，表明琼脂糖凝胶经过羧酸化处理后，表面成功引入了羧酸基团；图2d为螯合了金属镍离子的琼脂糖凝胶红外光谱，从图中可以看出，由于羧酸基团通过吸附配位作用与金属镍离子作用，碳氧键上的π电子发生离域，故该处羰基的吸收振动峰消失，证实了镍离子已经成功地螯合在了磁性琼脂糖凝胶微球的表面.进一步通过原子吸收光谱测试测定了Mag-Agarose-Ni表面螯合的Ni2+的量为2.12×10-5mol/mg.

金属鳌合亲和层析介质形貌以及表面粗糙程度直接影响介质的非特异性吸附的大小.介质表面越光滑，非特异性吸附越弱，分离效果就越好.图3为磁性琼脂糖磁性微球螯合Ni2+前后的SEM照片.从图中可以看出，磁性琼脂糖微球在螯合Ni2+后，其形貌上没有发生明显变化，说明在本实验条件下，磁性琼脂糖微球能很好地保持其原有形貌特征，微球表面依然比较光滑，可减小非特异的吸附[3].

图3 磁性琼脂糖凝胶微球螯合Ni2+前后的SEM照片

图4是Mag-Agarose-Ni在温度为300 K时的磁滞回线.从图中可以看出，外磁场从-10 KOe到10 KOe的循环扫描中，Mag-Agarose-Ni 磁滞回线重合为一条曲线，说明Mag-Agarose-Ni具有超顺磁性[4]，Mag-Agarose-Ni饱和磁化强度为20.8 emu/g，具有良好的磁响应性.

图4 Mag-Agarose-Ni的磁滞回线(300 K)

泳道1：分子质量标准蛋白;泳道2：洗脱液；泳道3：未被吸附物质.

2.2 用于六聚组氨酸融合蛋白亲和纯化

泳道1：分子质量标准蛋白；泳道2：经Mag-Agarose-Ni纯化处理后的洗脱液；泳道3：经Ni-NTA 纯化处理后的洗脱液.

用 Mag-Agarose-Ni对K8融合蛋白进行纯化，将得到的样品进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示.从图5中2、3泳道对比可以看出，经过Mag-Agarose-Ni吸附处理后，几乎所有的靶蛋白都结合在了Mag-Agarose-Ni上，经吸附后的残液中几乎没有靶蛋白条带出现，说明合成的Mag-Agarose-Ni对K8的亲和性好，非特异性吸附很小，经高浓度的竞争吸附剂咪唑洗脱后，得到了单一的K8融合蛋白条带，条带清晰，说明Mag-Agarose-Ni 对六聚组氨酸融合蛋白具有很好的分离效果.

图6是Mag-Agarose-Ni与市售的NTA-Ni对蛋白溶液的SDS-PAGE分析.从图中2、3泳道的对比可以看出，经Mag-Agarose-Ni纯化得到的洗脱液中，K8蛋白条带清晰，且其他蛋白条带不明显，而经Ni-NTA纯化得到的洗脱液中，尽管出现了目标蛋白K8的条带，但其他杂蛋白条带依然存在，进一步通过Bradford法对K8的纯化量进行了测试，Mag-Agarose-Ni和Ni-NTA对K8的吸附容量分别为8.8 μg/mg 和5.2 μg/mg.以上结果说明Mag-Agarose-Ni对六聚组氨酸蛋白K8有良好的纯化效果，选择性和纯化容量均优于市售的Ni-NTA，且可通过磁分离技术进行洗脱操作，简化了纯化步骤，适用于蛋白的大规模纯化.

3 结 论

1) 以自制磁性琼脂糖微球为基质，环氧氯丙烷为活化剂，亚氨基乙二酸作为螯合剂，制备了表面螯合Ni2+的磁性凝胶微球(Mag-Agarose-Ni).IR结果表明Ni2+成功螯合到了磁性凝琼脂糖胶微球上；SEM结果显示在螯合Ni2+后，Mag-Agarose-Ni形貌没有发生明显变化，且平均粒径为23 μm；原子吸收光谱显示Mag-Agarose-Ni表面螯合的Ni2+的量为2.12×10-5mol/mg；磁性能测试表明Mag-Agarose-Ni具有超顺磁性，其磁饱和强度为20.8 emu/g，具有良好的磁响应性.

2) 将Mag-Agarose-Ni用于六聚组氨酸融合蛋白K8的纯化研究，SDS-PAGE结果表明Mag-Agarose-Ni对K8有很好的亲和作用，分离效果好，经15 min的孵育后，Mag-Agarose-Ni对K8的吸附容量可达到8.8 μg/mg.

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