血必净对脓毒症大鼠体内MMP-9水平的影响及对肺脏的保护作用

侯俊德 宋子贤 张玉相 贾慧群

·论著·

血必净对脓毒症大鼠体内MMP-9水平的影响及对肺脏的保护作用

侯俊德 宋子贤 张玉相 贾慧群

目的通过对脓毒症大鼠血清中MMP-9浓度的影响并结合肺脏形态学及超微结构的变化，探讨血必净注射液对肺脏的保护作用及其作用机制。方法选用雄性S-D大鼠45只随机分为3组：空白组(Sham组)、盐水组(NS组)、血必净组(X组)，每组15只。检测血清MMP-9水平、肺湿/干重比(W/D)、HE染色法光镜观察肺脏形态学改变，透射电镜观察肺脏血管内皮细胞的超微结构。结果与Sham组比较，NS组、X组大鼠肺湿/干重比均明显增大(P<0.01)；与NS组比较，X组肺组织湿/干重比显著减小(P<0.01)。NS组、X组血清中MMP-9水平均显著高于Sham组(P<0.01)；与NS组比较，X组血清中MMP-9水平下降(P<0.01)。Sham组大鼠肺组织结构及血管内皮细胞结构基本正常；NS组有明显炎性反应及血管内皮细胞结构破坏等；X组改变明显减轻但较Sham组重。结论血必净注射液可减少血清MMP-9水平，从而减轻肺血管内皮细胞损伤，改善肺血管通透性，对肺脏有一定的保护作用。

脓毒症；基质金属蛋白酶-9；血必净注射液；血管内皮细胞；肺损伤

脓毒症是指病原微生物及其毒素、代谢产物侵入血液循环，激活宿主的细胞和体液免疫系统，产生各种细胞因子和内源性介质，而引起的全身炎性反应综合征[1]。通过对脓毒症病理生理研究发现，急性肺损伤(ALI)经常最早出现，而血管内皮细胞(VEC)损伤是影响上述演变的关键因素之一[2]。炎性因子基质金属蛋白酶-9(MMP-9) 在其中的作用也逐渐受到关注[3]。大量的动物实验以及部分临床试验结果均初步肯定血必净在联合治疗危重患者全身炎性反应甚至脓毒症中的疗效[4,5]。本实验采用Sprague-Dawley大鼠肓肠结扎与穿孔(CLP)法致脓毒症模型下，研究血必净注射液对血清MMP-9浓度的影响并结合肺脏形态学及超微结构变化，探讨应用血必净注射液治疗是否有效，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性Sprague-Dawley大鼠45只，体重250～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供。随机分为3组(每组15只)：空白组(Sham组)，盐水组(NS组)，血必净组(X组)。Sham组：盲肠不结扎也不穿孔，余操作相同，术毕尾静脉给予0.9%氯化钠溶液4 ml/kg。NS组：盲肠结扎穿孔(CLP)后，术毕尾静脉给予0.9%氯化钠溶液4 ml/kg。X组：CLP后给予血必净注射液(天津红日药业股份有限公司)4 ml/kg尾静脉注射(生药浓度为500 g/L)。

1.2 模型建立 Sprague-Dawley大鼠实验前饲养1周以适应实验室条件，实验前12 h禁食不禁水，实验时称重。腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，相对无菌条件下行左侧颈动脉置管。采用经典的盲肠结扎穿孔法(CLP)制模，其中Sham组不行盲肠结扎与穿孔，余操作相同。在造模6 h采血、取肺组织。

1.3 标本采集及观测指标

1.3.1 血清留取：由右颈总动脉测压管处缓慢采血2 ml，离心后留取上清液，转入EP管，于-70℃冻存，待全部实验结束后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中MMP-9含量。

1.3.2 肺组织留取：经右颈动脉采血处死后，开胸取右肺中叶，精确称湿重，再置于85℃烤箱中24 h，至重量不再变化，称干重，计算肺湿/干重比。

1.3.3 HE标本留取：由右颈总动脉采血处死动物后，迅速剪取右肺下叶放入4%的多聚甲醛中，浸泡固定72 h后包埋蜡块做HE染色用。

1.3.4 电镜标本留取：处死动物后，迅速剪取右肺下叶放入4%的戊二醛中固定，H-7500透射电子显微镜(日本日立)镜检。

1.4 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，采用完全单因素方差分析，方差不齐时采用非参数的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠肺组织湿/干重比(W/D)变化 与sham组比较，NS组大鼠肺组织W/D明显增大(P<0.01)；X组肺组织W/D也显著增加(P< 0.01)；与NS组比较，X组肺组织W/D显著减小(P<0.01)。见表1。

2.2 3组大鼠血清MMP-9水平变化 NS组血清中MMP-9水平显著高于Sham组(P<0.01)；X组水平也比Sham高(P<0.01)；与NS组比较，组MMP-9水平明显下降(P<0.01)。见表1。

组别W/DMMP⁃9(ng/ml)Sham组4．54±0．164．5±1．0NS组5．15±0．11∗11．5±1．7∗X组4．74±0．08∗#7．5±1．8∗#

注：与Sham组比较，*P<0.01；与NS组比较，#P<0.01

2.3 肺组织病理学改变

2.3.1 HE染色光镜下观察：Sham组大鼠肺组织结构完整，肺泡间隔无水肿，肺泡腔清晰；NS组肺泡间隔增宽，肺间质充血、水肿，肺泡腔可见大量中性粒细胞浸润，可见不同程度的肺不张，代偿性肺气肿等；X组改变明显减轻但较假手术组重(图1～3)。

2.3.2 电镜下观察：Sham组基本正常，内皮细胞边缘清楚，细胞连接紧密，胞内可见少量吞饮小泡；NS组肺血管内皮细胞细胞连接模糊不清，胞浆内含有大量吞饮小泡；X组内皮细胞胞浆内有少量吞饮小泡，可见内皮细胞间隙(图4～6)。

图1 Sham组肺组织病理变化(HE×200)

图2 NS组肺组织病理变化(HE×200)

图3 X组肺组织病理变化(HE×200)

图4 Sham组肺血管内皮细胞病理变化(透射电镜×3000)

图5 NS组肺血管内皮细胞病理变化(透射电镜×3000)

图6 X组肺血管内皮细胞病理变化(透射电镜×3000)

3 讨论

脓毒症是感染导致全身炎性反应综合征为特征的临床症候群，其发病率和病死率均很高[1]，其中肺脏是脓毒症时最易受损的靶器官。在脓毒症的发展过程中，肺损伤的主要病理特征是肺内炎性反应失控导致肺泡毛细血管损伤[6]，通透性增高，引起肺泡渗出液中富含蛋白质的肺水肿及透明膜形成，导致ALI/ARDS[7]。近年来，抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但严重脓毒症的病死率仍高达30%～70%[8]。

本实验采用CLP模型，这是目前比较公认的临床相关性较强的脓毒症动物模型[9]。实验当中，在CLP后2～3 h大鼠可自由饮水，NS组6 h出现精神倦怠、躁动、寒战、腹胀、眼角分泌物增多、竖毛等表现，剖腹见腹腔内有血性渗出液，盲肠肿胀变黑、发生粘连，空肠肠管胀气等表现，与Wu等[10]报道的脓毒症大鼠动物模型基本相同，符合脓毒症的表现，制模成功。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类由金属离子作为辅酶参与全酶构成的蛋白质水解酶[11],在正常情况下MMPs表达量很少，但活化的中性粒细胞、内皮细胞等可释放大量的MMP-8和MMP-9等，其中MMP-9因作用底物广泛,表达细胞众多而备受重视，成为最近国际国内研究的焦点之一[10]。MMP-9一旦过度表达能够降解血管基底膜，增加血管通透性，促进中性粒细胞在组织的粘附和浸润，进一步释放 TNF-α、IL-6 等炎性因子，进一步促进 MMP-9 的生成和释放，形成炎性反应的级联放大效应[12]，严重者导致全身炎性反应综合征。在ARDS动物模型中发现，MMPs抑制剂可减缓其病理进程[13]。

血管内皮细胞在脓毒症的发生发展过程中具有重要的作用。它不仅是脓毒症发生时受损的靶器官，还通过其广泛的生物学功能主动参与了器官功能的损伤[14]。是凝血启动和炎性反应激活过程中重要的效应细胞，而脓毒症病理生理学变化是严重全身感染引起的炎性反应过度激活及凝血机能障碍。因此，血管内皮细胞活化和功能障碍是脓毒症发展恶化的中心环节。

中医中药对脓毒症患者有较好疗效。血必净注射液是赤芍药、川芎、丹参、红花等活血化瘀药提取物，大量基础研究以及临床实践证明,血必净注射液具有强效抗内毒素作用，也有强效拮抗源性炎性介质、失控性释放的作用,改善弥漫性血管内凝血的凝血机制异常，调节过高或过低的免疫反应，保护和修复应激状态下受损的脏器[15]。据报道血必净能改善CLP术后脓毒症大鼠多器官功能异常，并降低动物的病死率[16]。

本试验通过对脓毒症大鼠一般情况观察、肺湿干重比变化、血清MMP-9水平变化，以及肺脏病理学显示，必净注射液能够改善脓毒症大鼠的一般状况，减轻炎性反应和毛细血管渗漏，减轻脓毒症大鼠肺损伤，改善肺功能，这可能与减少MMP-9的过度释放、活化，减轻肺血管内皮细胞损伤有关。

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本刊编辑部

EffectofXuebijinginjectiononMMP-9levelsanditsprotectioneffectonlungsofratswithsepsis

HOUJunde*,SONGZixian,ZHANGYvxiang,etal.*DepartmentofAnesthesia,HandanCentralHospital,Hebei,Handan056001,China

ObjectiveTo investigate the changes of serum levels of MMP-9 and the pathological changes of lung tissue in rats with sepsis induced by CLP,and to explore the protection effect and action mechanism of Xuebijing injection.MethodsForty five male SD rats were randomly divided into 3 groups: blank group,NS group and Xuebijing group.Serum MMP-9 levels and the ratio of lung wet/dry weight were determined.The pathologic changes of lung were observed by means of light microscopy and transmission electron microscopy.ResultsAs compared with that in blank group,the ratio of lung wet/dry weight in NS group and Xuebijing group was significantly increased (P<0.01),however,as compared with that in NS group,the ratio of lung wet/dry weight in Xuebijing group was significantly decreased (P<0.01).The serum levels of MMP-9 in NS group and Xuebijing group were significantly higher than those in blank group (P<0.01).As compared with those in NS group,the serum levels of MMP-9 in Xuebijing group was significantly decreased (P<0.01).The lung tissue structures and vascular endothelial cell structures in blank group were basically normal,however,obvious inflammatory reaction and vascular endothelial cell structure injury were found in NS group,which in Xuebijing group were obviously relieved,however,which were severer than those in blank group.ConclusionXuebijing injection can reduce MMP-9 levels,as a result,which can relieve lung vascular endothelial cell injury and improve pulmonary vasopermeability,so Xuebijing injection has certain protection effect on lungs.

sepsis；MMP-9; Xuebijing injection; vascular endothelial cell injury; lung injury

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.001

056001 河北省邯郸市中心医院麻醉科(侯俊德)；河北医科大学第四医院麻醉科(宋子贤、贾慧群)，ICU(张玉相)

R 631.2

A

1002-7386(2014)05-0645-03

2013-11-28)