血红素加氧酶-1启动子基因多态性与食管鳞癌的相关研究

王献伟 黄金娜 王爱玲 李延峰 解俊霞

·论著·

血红素加氧酶-1启动子基因多态性与食管鳞癌的相关研究

王献伟 黄金娜 王爱玲 李延峰 解俊霞

目的探讨血红素加氧酶-1(HO-1)基因启动子序列的(GT)n双核苷酸重复多态性与食管鳞状上皮癌的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术在93例食管癌患者和98例正常对照人群中检测HO-1基因多态性，比较基因型及等位基因在2组的分布。结果2组人群在年龄、性别比、血糖、血脂水平分布无明显差异；重复 32次的长等位基因(L等位基因)的频率在食管癌组要显著高于对照组(26.9%比14.2%,P<0.05)。结论HO-1基因启动子区域的(GT)n双核苷酸重复多态性可能与食管鳞状上皮癌的易感性相关。较长的(GT)n重复等位基因HO-1启动子与食管鳞状上皮细胞癌的风险，而较短(GT)n重复等位基因可能在食管鳞状上皮细胞癌的发生起保护作用。

血红素加氧酶；基因多态性；食管肿瘤

血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)是血红素分解代谢过程中的一种限速酶，HO的作用之一是可将血红素分解为一氧化碳(carbon monoxide，CO)、Fe、胆绿素。HO-1的产生过程是一种对有害性刺激的适应性及保护性反应,并与临床上某些相关疾病密切相关，在肿瘤细胞中普遍呈高表达状态。近年来有研究表明，HO与肿瘤的增殖、血管发生和细胞凋亡等生物学行为密切相关。HO-1基因启动子有一双核苷酸(GT)n重复序列，具有较高的多态性，能影响其基因的转录活性。通过体外实验测定(GT)n重复次数，能间接了解机体内HO-1的遗传表达程度。较长的重复序列HO-1转录活性较低[1]，并且有报道较长的重复序列(GT)重复增加心血管疾病的易感性，导致慢性阻塞性肺疾病，肺腺癌口腔癌等[2]。我们对食管癌患者和健康对照者的血红素加氧酶-1基因启动子序列的(GT)n双核苷酸重复多态性进行了对照研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本部分191例食管鳞癌患者中有完整病例资料，石蜡包埋组织块(手术切除标本或活检标本)及血样标本的共93例。所有病例均为39岁以上，年龄39～75岁,平均58.5岁。所有病例临床资料完整,按照WHO 2003年AJCC第六版PTNM分期标准食管癌分期，11期25例，三期33例,四期35例。无纵隔淋巴结转移45例，有纵隔淋巴结转移48例。高分化鳞中分化鳞癌42例，低分化鳞癌51例。对照组98例为同期所取经检测为健康的标本。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取：采外周血2 ml(EDTA抗凝)，采用常规酚/氯仿法提取，用紫外光分光光度计检测DNA的浓度和纯度，DNA纯度=A260/A280，比值结果范围为1.6～1.8，说明样品DNA杂质少，纯度高；如果DNA纯度<1.60，表明蛋白含量太高或者有残存酚，需再提取纯化。

1.2.2 HO-1基因启动子区序列多态性分析：应用PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测HO-1基因启动子区列GT重复数目。

1.2.3 PCR反应：①引物设计 (由上海生工生物工程公司合成)。上游引物P1：5’-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGA-3’下游引物P2：5’-ACAAAGTCTGGCCATAGGAC-3’②PCR反应体系：采用50 μl反应体系，每体系含ddH2O:36.5 μl;10×Buffer:5 μl;引物P1:1 μl;引物P2:1 μl;10 mmol/L dNTPs:1 μl;Taq酶：0.5 μl;基因组DNA2.0 μl。③PCR扩增条件：95℃变性30 s；55℃复性30 s；退火延伸72℃ 30 s，共31个循环。

1.2.4 1.5%琼脂糖凝胶电泳：用TAE缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸直至琼脂糖溶解，待冷却到60℃时，加入溴化乙锭(10 mg/ml)使其终浓度为0.5 mg/ml,混匀后灌胶。待胶凝固后放入含TAE电泳液的电泳槽内，使TAE液盖过凝胶。取10～15 μl提取的各组DNA样品液与上样缓冲液(含0.25%溴酚兰，4%蔗糖)按4∶1比例混匀后点样。60 V电泳1 h。

1.2.5 染色及结果鉴定：电泳结束后，将凝胶取出，放入小托盘中，用全自动凝胶成像仪观察梯形条带，并摄影记录各标本的基因型。

1.2.6 基因型的判定[3]：由于HO-1启动子区基因多态性是由双核苷酸(GT)重复序列的数目不同而引起，是一种长度重复的多态性，所以可以直接对其PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，通过捷达凝胶显像系统来计算该电泳片段的总长度，除去固定碱基序列的数目，即能推算出双核苷酸重复的数目。查阅Genebank Accession Nos AF145047.1核对HO-1基因启动子区域基因序列发现两引物之间共有127个序列5"-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGATTTCCTT’AAAGGTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAT；GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTCTCTAAA；AGTCCTATGGCCAGACTTTGT- 3’产物中GT重复两端的固定序列长度为:127-(30×2)=67(bp)。这样推算出，GT重复次数=(产物长度-67)/2。通过捷达凝胶显像系统来计算其电泳片段的总长度，除去固定碱基序列的数目，依次来推断双核苷酸重复的数目。根据重复次数的差别分为三种序列：重复次数≤25者为小量重复序列(S型位点);重复次数处于26～30者为中量重复序列(M型位点)；重复次数大于或等于31则为大量重复序列(L型位点)。基因型的计算采用直接计数法，公式为等位基因频率=(该基因纯合子个体数×2+该基因杂合子个体数)/总个体数×2。

2 结果

2.1 2组间年龄、性别比较 2组间年龄经、性别构成经比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组各项一般临床数据比较

2.2 HO-1基因PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后结果 因为划分了三种等位基因S、M、L所以得到六种基因型。见图1。

2.2.1 基因型分布 HO-1基因启动子区(GT)n重复序列在对照组和食管癌组中的基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2.2 HO-1等位基因在对照组和食管癌组的分布 食管癌组的L等位基因频率要明显高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.3 各基因型及等位基因在对照组及食管癌组中的分布比较 根据各基因的电泳结果，计数其基因型。

1，7：marker；2～6：SL，SL， ML， ML，LL；8～11：SL，SS，SM，SM
Marker条带从小到大依次为67、110、147、190、242、331、404、489、451、692、881

图1 HO-1基因PCR产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳图像(10%)

表2 HO-1基因启动子区在对照组和食管癌组的基因型分布 例

表3 对照组和食管癌组HO-1等位基因分布频率比较 例(%)

3 讨论

从我们的病例对照研究分析结果看,携带HO-1 L等位基因食管鳞癌的发病风险明显高于对照组，差别是有统计学意义的。在这种本次对照研究中，我们发现了HO-1启动子GT重复长度之间与食管鳞状上皮癌的关系，尤其是GT重复大于31增加了患食管癌的风险，这表明，较短的GT重复等位基因可能对食管癌有保护作用。

消化道疾病中，HO-1的水平增加，并发挥其对消化道的积极作用，主要是抗炎抗氧化等细胞保护作用[2]。血红素在HO-1的作用下，降解为一氧化碳(CO)、胆绿素和铁，胆绿素随后被还原为胆红素。HO-1不仅在体内起到维持血红素水平稳定的作用，HO-1酶促反应及其产物在人体内具有调节和保护作用。胆红素和胆绿素在一定浓度下是内源性强抗氧化剂 具有抗氧化、抗脂质过氧化，保护细胞免受损伤及增强维生素C和维生素E抗氧化能力等作用。除此之外，胆红素也被报道具有调节免疫反应和抑制炎症反应的作用。许多研究证实胆红素/胆绿素在许多病理条件下具有强大的细胞保护作用[4]。根据亚洲人的基因特点，HO-1基因启动子序列(GT)n 重复次数值为10～39，22、29、33分别为其中的三个重复高峰，并且该研究还划分了3个等位基因：S型位点n≤25; M型位点26～30;L型位点n≥31[5]。本研究发现L等位基因的频率在食管癌组为26.9%明显高于对照组14.2%，说明携带HO-1 L等位基因食管鳞癌的发病风险明显高于对照组，相反较短的GT重复等位基因可能对食管癌有保护作用。

以往的研究表明，虽然HO-1启动子多态性多态性可能会影响转录但对肿瘤的进展没有影响，它可能排除HO-1的作用多态性作为肿瘤传播的风险指标。本研究证实了HO-1基因启动子区域的(GT)n长度重复多态性很可能是食管癌的易感基因，当然，要证实该结论还有待于提高样本量来进一步研究。

总的来说，我们的线索表明，长GT重复等位基因HO-1启动子和食管癌相关的风险。研究结果还表明，较短的GT重复HO-1启动子等位基因可能在食管癌中的保护作用。

1 Kikuchi A,Yamaya M,Suzuki S,et al.Association of susceptibility to the development of lung adenocarcinoma with the heme oxygenase-1 gene promoter polymorphism.Hum Genet,2005,116:354-360.

2 Chang KW,Lee TC,Yeh WI,et al.Polymorphism in heme oxygenase-1 (HO-1) promoter is related to the risk of oral squamous cell carcinoma occurring on male areca chewers.Br J Cancer,2004,91:1551-1555.

3 刘智贤.HO-1启动子区基因多态性与高血压和冠心病的相关性研究.天津医科大学.2008.

4 Sawle P，Hammad J，Fairlamb I J，et al．Bioactive properties of iron-containin g carbon monoxide-releasing molecules(CO-RMs).J Pharmaeol Exp Ther,2006，318：403.

5 Fu WP,Zhao ZH,Fang LZ,et al.Heme oxygenase-1 polymorphism associated with severity of chronic obstructive pulmonary disease.Chin Med J (Engl),2007,120:12-16.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.009

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20120447)

050011 河北省石家庄市第一医院(王献伟、王爱玲、李延峰)；河北省医学情报研究所(黄金娜、解俊霞)

R 735.1

A

1002-7386(2014)05-0668-03

2013-12-11)