Survivin在甲状腺癌中的表达及临床意义

田忠成,邵飞飞,党雪菲,邱 实

(吉化集团公司总医院 化疗科,吉林 吉林132012)

甲状腺癌为较常见的恶性肿瘤,约占所有恶性肿瘤 1%,在甲状腺肿瘤中约占 5%,占癌症死亡病例的 0.4%,多发于中青年女性,它严重威胁着人类健康。因此对于甲状腺癌的预防、检测和治疗是当前肿瘤研究的一个重点。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的新成员,在细胞分裂和凋亡调节上均发挥作用。尤其是其抑制凋亡作用直接或间接的与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制相关。目前,Survivin 在甲状腺癌中的表达相关性研究尚无文献报道。

1 材料与方法

1.1标本选取吉化集团公司总医院近三年甲状腺癌手术切除标本35例：按组织学分型分为乳头状腺癌(PTC)10例,滤泡状癌(FTC)13例,髓样癌(MTC)12例,另选正常甲状腺组织12例。患者术前均未行放疗或化疗。收集的所有组织均分成两份,一部分放入10%中性福尔马林,常温下固定用于免疫组织化学染色实验,一部分保存于-80℃冰箱中,用于组织匀浆后进行RT-PCR检测。

1.2试剂与引物免疫组织化学染色采用SP法。抗Survivin人单克隆抗体 购自Santa Cruze公司,S-P二抗试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新公司。

1.3方法

1.3.1 免疫组化按试剂盒说明书操作。用已知Survivin阳性的甲状腺癌切片作阳性对照,结果为阳性。用己知Survivin阴性的乳腺癌切片作阴性对照,结果为阴性。 用PBS液代替一抗体作空白对照,结果为阴性。

1.3.2 RT-PCR 按Trizol试剂操作说明提取RNA,逆转录反应按照RT反应试剂盒说明书进行。Survivin引物:扩增片段长度816 bp,上游引物：5′- TTTTCATCGTCGTCCCTA-3′ 下游引物：5′-GTTTGGCTTGCTGGTCTC-3′。GAPDH引物：扩增片段长度616 bp上游引物：5′- GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′ 下游引物：5′- AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′。取PCR反应液10 μl进行琼脂糖凝胶电泳,利用1D KODAK凝胶图像分析系统摄片。

1.4 结果判定

1.4.2 RT-PCR阳性条带判定方法 与Marker 相比较在 816bp 和 616bp 处出现阳性条带者分别判定为Survivin 和 GAPDH mRNA 阳性表达；如在对应区域未见阳性条带出现,则判定为阴性。用内参照(GAPDH)光密度值标化Survivin mRNA 的吸光度值,得到Survivin mRNA 表达的相对含量。具体计算公式如下： Survivin相对含量=(Survivin光密度值/GAPDH光密度值)×100。

2 结果

2.1 SP法免疫组织化学染色结果显示,在不同组织学类型的甲状腺癌中,Survivin的表达强度存在差异。在10例甲状腺乳头状癌中,6例表达阳性,阳性率为60%。在13例甲状腺滤泡癌中,9例表达阳性,阳性率69.2%。在12例髓样癌中,11例表达阳性,阳性率为91.6%。而12例正常甲状腺组织中,2例表达阳性,阳性率为16.7%。根据阳性结果判断标准,Survivin在不同组织学分型的甲状腺癌中表达强度存在差异。统计结果显示,Survivin在正常甲状腺组织中的表达与乳头状甲状腺癌、滤泡癌、髓样癌中的表达相比均具有显著差异(P<0.05)。在甲状腺癌中,不同组织学类型中Survivin表达具有差异,随着其组织学恶性度的增加,Suivivin表达增强(表1)。

表1 Survivin在正常甲状腺及甲状腺癌中的表达及其与组织学分型的关系

注：*乳头状癌、滤泡癌、髓样癌与正常甲状腺比较P<0.05

2.2RT-PCR检测电泳结果显示,所有检测的甲状腺癌及正常甲状腺组织均在816 bp处出现条带,但各组之间条带亮度存在差异(图1)。Survivin在甲状腺乳头状癌中的相对表达值为59.154±10.086,在滤泡癌中的相对表达值为67.25±8.478,在髓样癌中的相对表达值为86.898±6.944,而在正常甲状腺组织中的相对表达值为32.148±9.513。与正常甲状腺组织相比。Survivin在各组织分型的甲状腺癌中表达显著提高(P<0.05)。Survivin在甲状腺癌中的表达随甲状腺癌组织学恶性度的提高而呈上升趋势(图2)。

1：Marker 2：正常甲状腺 3：乳头状癌 4：滤泡癌 5：髓样癌

*与正常甲状腺比较P<0.05

3 讨论

Survivin是新近发现的抑制凋亡蛋白(IAP)家族中的新成员,在肿瘤细胞的凋亡过程中的调控作用已受到科学工作者的关注。Survivin的表达具有特异性,除在发育的胚胎组织中,Survivin仅存在于胸腺、睾丸和分泌期的子宫内膜,但在转化的细胞系和所有人类最常见的恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌中大量表达。Survivin的这一表达特性提示了细胞凋亡调控和肿瘤发生发展之间的之间关系,因此,Survivin有可能成为肿瘤诊断治疗的一个理想靶点。

3.1Survivin的结构和抗凋亡作用Survivin 是 1997 年筛选克隆出来的新基因。人类 Survivin 基因位于染色体 17q25,全长 14.7kb,由 3 个内含子和 4 个外显子组成。Survivin是分子量最小的凋亡抑制蛋白分子。它的基因编码一个由 142 个氨基酸组成的分子量约为 16.2kD 的胞浆蛋白[1]。其结构独特,仅含有单一的杆状病毒 IAP 重复序列功能区和一个á螺旋,没有锌指结构。Survivin 通过其不同的氨基酸残基与半胱氨酸蛋白酶 Caspases-3 和 Caspases-7 结合抑制 Caspases 的活性。同时通过其一个á螺旋结构与细胞分裂微观结合,抑制细胞凋亡[2]。大量研究表明Survivin的表达具有细胞周期依赖性,只在细胞周期的G2/M期表达,并与细胞分裂、增殖有关。

研究结果表明 Survivin 是迄今发现最强的凋亡抑制因子,它的作用远远大于bcl-2家族的作用。它能够直接抑制Caspases-3和Caspases-7的活性[3]。正常情况下,活化的 Caspase 酶具有严格的底物特异性和高效性,它可以以一种和谐的方式选择剪切一组蛋白质,导致其功能的丧失或结构变化,而促使细胞凋亡。当 Caspases 的活性受到抑制,细胞凋亡与增殖之间的动态平衡失调时,就可能引起多种肿瘤的发生发展。李鹏[4]等发现Survivin 基因对人乳腺癌 MCF-7 细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。Bobayashi 等研究发现,在细胞增殖的组织中均有 Survivin 表达。Survivin 在胚胎组织中规律性表达,参与细胞的生长、分化[3]。在激活的鼠脾脏 T 细胞和处于细胞周期 S 到G2/M 期的 NIH3T3 细胞均有 Survivin 表达,可见,Survivin 表达与细胞分裂、增殖有关。

3.2Survivin在肿瘤中的表达及其与肿瘤的关系研究发现,Survivin 可广泛表达于人类各种肿瘤组织,它在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。体内外研究表明,Survivin 可在多种转化细胞中表达,Serela等[5]发现结肠癌中Survivin表达水平同结肠癌的病理进程相关。Survivin表达阳性患者5年生存率明显低于Survivin表达阴性患者,提示Survivin表达水平是结肠癌患者预后判断的重要指标。Falleni等[6]发现Survivin在非小细胞肺癌肿瘤标本中的表达率明显高于正常肺组织标本的表达率,在所有肺癌组织学类型中鳞状细胞癌Survivin表达最高。Dong等[7]对102例喉癌进行研究发现,临床Ⅲ期-Ⅳ期患者的Survivin的阳性表达率显著高于Ⅰ期-Ⅱ期的Survivin的阳性表达率；病理分级Ⅲ级患者的Survivin的阳性表达率显著高于I级患者的Survivin的阳性表达率。李世金等[8]发现Survivin蛋白的表达降低在正常子宫内膜向内膜样腺癌的转变中起重要作用;其低表达与子宫内膜样腺癌的病理分期、组织学分级无明显相关性。李庆霞等[9]发现Survivin与乳腺浸润性导管癌侵袭和转移有关,有助于判断预后。Survivin 表达预示着肿瘤有较高的侵袭性和不良预后。可作为预测肿瘤的发生发展和预后的一个新指标。

3.3Survivin在甲状腺癌表达及其临床意义在甲状腺癌方面,也有学者研究了Survivin的表达及其同临床指标的相关性。刘钢等[10]利用免疫组织化学方法检测了68 例甲状腺癌、54 例甲状腺腺瘤、 32 例癌旁组织和 23 例正常甲状腺组织中的Survivin表达情况,结果显示Survivin 过量表达可能与甲状腺肿瘤的发生发展有关,癌组织中 Survivin的表达可作为判断甲状腺癌病理类型和预后的参考指标。卢秀波等[11]检测了Survivin在正常甲状腺和分化型甲状腺癌(DTC)的表达情况,结果显示Survivin在正常甲状腺组织中表达阴性,在DTC中的表达阳性率为59.6%,并与有无淋巴结转移密切相关。董文荣等[12]探讨了分化型甲状腺癌组织中Survivin的表达同肿瘤微血管形成的关系。结果表明,在47例分化型甲状腺癌中Survivin的阳性表达率为46.8%,甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织中均为阴性。Survivin的表达同甲状腺的临床分期、肿瘤包膜完整情况及颈部淋巴结转移等密切相关。

本实验中,我们检测了Survivin蛋白在不同组织学类型甲状腺癌中的表达情况,其结果同其它研究者的研究结果基本一致,在正常甲状腺中呈阴性表达,在乳头状癌、滤泡癌和髓样癌中的表达率分别为60%、69.2%和91.6%。表达强度随着肿瘤恶性度的增高而增高。提示Survivin可能在甲状腺癌发生中发挥重要作用并同甲状腺癌的恶性度、进展等密切相关。阳性表达率稍高于其他研究者的研究结果,这可能与我们的标本来源、标本数量及阳性结果判断标准存在差异有关。同时,我们还运用RT-PCR方法检测了Survivin mRNA在正常甲状腺和甲状腺癌中的表达,得到了与免疫组织化学相同的结果。在正常甲状腺组织中,我们同样检测到了Survivin mRNA的极低表达,这可能同RT-PCR的高灵敏度相关。由于标本来源问题,我们没有建立甲状腺癌的相关临床指标库。但是综合我们同其他研究者的研究结果,我们认为 Survivin在甲状腺癌的发生发展过程中发挥重要作用,与甲状腺癌的浸润侵袭、转移等密切相关,可能成为甲状腺癌患者预后判断的重要指标,也可能是甲状腺癌临床诊断治疗的新靶点,具有重要的临床意义。

作者简介：田忠成(1971-),男,硕士研究生，吉化集团公司总医院化疗科 副主任医师。主要研究方向为肿瘤内科诊断与治疗。

参考文献：

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[4]李 鹏.Survivin 基因干扰和过表达对人乳腺癌 MCF-7细胞凋亡的影响 [J].中国生物制品学杂志,2013,26(7):959.

[5]Sarela AI,Macadam RC,Farmery SM,et al. Expression of the anti-apoptosis gene,survivin,predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J]，Gut，2000，46:645.

[6]Falleni M,Pellegrini C,Marchetti A,et al.Survivin gene expression in early-stagenon-small cell lung cancer[J].J Pathol,2003,200(5)∶620.

[7]Dong Y,Sui L,Watanabe Y,et al.Survivin expression in laryngeal squamous cell carcinomas and its prognostic implications[J].Anticancer Res.2002,22(4)：2377.

[8]李世金,张爱臣,佟玲玲,等.Survivin蛋白在子宫内膜癌中的表达及其临床意义[J].中国实验诊断学,2013,17(1):88.

[9]李庆霞,邢雅军,闫晓路,等.乳腺浸润性导管癌Survivin和AIB-1表达及其相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(12):935.

[10]刘 钢,史火喜,袁又能,等.凋亡抑制基因 Survivin在甲状腺癌组织中的表达及意义[J].中华临床医师杂志(电子版),2011,5(3):840.

[11]卢秀波,安兆峰,王庆兆,等.Survivin和c-myc在分化型甲状腺癌中的表达及临床意义[J].中华实验外科杂志,2004,21(6)：705.

[12]董文荣,李晓明,路秀英,等.Survivin 在分化型甲状腺癌组织中的表达及其与肿瘤微血管形成的关系[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2006,20(21)：967.