自发性高血压大鼠血液miRNAs表达分析

鞠传静，王旭渤,梁斌斌，李 颖,于 冰

(1.一汽总医院 心内科，吉林 长春130011；2.邯郸钢铁有限责任公司职工医院；3.解放军95810部队卫生队)

高血压病是一种危害人类健康的常见病和多发病，容易引起冠心病、脑卒中等一系列心脑血管疾病。随着社会老龄化的加剧、人们生活水平的提高、生活节奏的加快以及饮食结构的改变，高血压病发病率持续上升，并呈现出年轻化的趋势[1]。该病及其并发症的预防、治疗已广泛受到医学界和科学界的关注。世界各国均十分重视高血压病发病机理以及临床防治的研究。高血压病是我国居民健康的主要威胁，目前全国高血压患者已达2亿人。虽然高血压病被确定为心血管疾病的重要危险因素已近50年，但如何预防及有效控制依然是世界性难题，其主要障碍是 95% 以上的高血压为病因不明的原发性高血压，因此难以进行有效的早期预防和治疗[2,3]。

microRNA (miRNA)是一类长约18-25nt的单链非编码小RNA，主要通过结合于靶基因的3'非翻译区抑制靶基因的翻译或导致mRNA降解，从而抑制靶基因的表达。miRNA 在许多生物学过程中发挥重要的调控作用，如细胞增殖、分化、凋亡、癌症发生等。最近研究表明，miRNA 也参与调控心血管系统的发育和疾病发生过程。深入理解miRNA调控高血压病的机制，不仅有利于阐明高血压病发病的分子机制，而且有利于制定更好的治疗策略。

本课题组前期对SHR大鼠和正常大鼠血液进行miRNA差异表达分析(miRNA芯片)，在此研究基础上筛选出差异表达显著的miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*进一步分析研究，将为人类高血压诊断及治疗研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF级自发性高血压大鼠(合格证号：SCXK(京)2012-0027) 北京维通利华公司，质量(200±20) g，10只，12周龄。实验期间以常规大鼠饲料饲养，自由饮用自来水，并适应性喂养1周后进行实验。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，DEPC购于美国Sigma公司，TSYBR Premix Ex TaqTM ‖(Perfect Real Time)购于日本TaKaRa公司，PrimeScript RT reagent Kit购于日本TaKaRa公司，7300荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。

1.3 引物设计

根据miRBase数据库,分别设计检测鼠源miR-448-5p、miR-128、miR-146a、miR-24-2*及对照U6的引物，引物序列见表1。

1.4 RNA 的提取

每只大鼠尾静脉采集血液250 μl，按TRIzol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理水溶解RNA。检测总RNA溶液260 nm及280 nm处的吸光度值，计算总RNA浓度和纯度，吸光度比值>1.8可用于检测。

1.5 miRNA特异性反转录

参照PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒说明操作合成cDNA：5×primer script buffer 4 μl，Enzymix 反转录酶1 μl，RT反转录引物0.5 μl，RNA 2 μg，加水(无RNA酶) 补至20 μl体系；反应条件为:42℃温育30 min， 85℃ 5 min 灭活逆转录酶，4℃保存备用。

1.6 荧光定量PCR(qRT-PCR)

实时荧光定量PCR，20 μl反应体系:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，模板cDNA 2 μl，上下游引物(10 μM) 各0.5 μl，双蒸水定容至20 μl。采用已经优化好的条件进行实时定量PCR检测。反应结束后,软件系统自动得出熔解曲线，分析相对表达量，得到RQ值，引物如表1(U6作为内源性对照)。

1.7 统计学分析

采用SPSS16.0软件进行统计分析所有数据，结果采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 miRNA-448等4种miRNA的RT引物和qPCR引物序列

2 结果

2.1 RNA质检结果

采用紫外吸收测定法测定提取的大鼠血液总RNA纯度及浓度，结果显示，所有样本的D260nm/D280nm均为1.8-2.0之间，说明RNA提取的质量好，基本上无蛋白质、核酸的污染，可以用于后续实验。

2.2 荧光定量PCR的条件优化及特异性

miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*的实时定量PCR反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性10 s、65℃退火43 s，共45个循环，重复3次取平均值。结果如图1、2，无非特异性的扩增产物条带，熔解曲线图只有一个产物熔解峰，Tm值为80.25℃。

2.3 荧光定量PCR标准曲线的分析

miR-448-5p和U6 RNA的相关系数R2均大于0.98,并在10-3-10-7范围内以10倍倍比稀释这样一大跨度范围内DNA的拷贝数与循环域值(Ct)之间存在着良好的线性关系，说明该检测样品具有非常好的可重复性。miR-448-5p和U6的扩增效率非常接近,满足比较阈值法的前提条件,可以进行相对定量(图3、4)。

图1 miRNA-448-5p和U6的扩增曲线 图2 miRNA-448-5p的熔解曲线 图3 miRNA-448-5p荧光定量PCR标准曲线 图4 U6荧光定量PCR标准曲线

2.4 SHR大鼠血液中miRNA-448-5p等4种miRNA荧光定量PCR

结果显示，SHR大鼠血液中miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*表达水平均上调2倍以上，且差异极显著(与对照组相比，P<0.01，见图5)，实验结果与前期SHR大鼠血液miRNA芯片结果一致。

*表达分析注：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

miRNAs是一类自然形成的非编码RNA,人们已经发现了700多种miRNAs[4]，其中不少miRNAs分子已经被证实与多种疾病的发生有关,miRNAs研究的发展使其能够作为各种疾病的生物学标志物。Wang等发现miR-208a在正常人血液中不表达，而心肌梗死患者血清中表达，具有特异性及敏感性，可作为心肌梗死诊疗的一种生物标志物[5]。本文结果显示高血压组miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*表达均上调，与对照组比较差异显著，有统计学意义(P<0.001)。何凤屏等发现原发性高血压并发心肌缺血患者miRNA-21等miRNA上调[6]，于丽萍研究原发性高血压的let-7e等miRNA上调[7]，这些上调的miRNA作为高血压病诊断标志物，有待于人们进一步研究确证。血液中miRNAs的水平和活性变化参与心血管疾病的病理过程，在检测中具有独特优势，在心血管疾病的诊断及治疗中具有非常重要的意义。

miRNAs有茎环RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)[8](本研究主要采用此方法)、poly( A)加尾RT-PCR 方法[9]及Northern印迹法、小RNA芯片法、深度测序法等方法[10-14]。随着这些技术的不断优化、成熟，miRNA 检测变得更容易、快捷和便宜，

为它在临床疾病诊断中的应用奠定基础。

血液miRNA作为分子标志物将改变和补充对高血压发生发展的传统认识，提供高血压诊断和治疗新的生物标志物。随着血液miRNA检测方法的标准化，以及对血液miRNA的生成机制、生物学功能和与相关高血压关系的逐步阐明，可以相信血液miRNA在未来的临床诊断和预后中将展示出广阔的临床应用前景。

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[7]于丽萍，史琳影，张明明，等.原发性高血压的微小RNA表达谱及其机制的初步研究[J]．中华心血管病杂志，2011，39，(6)：488.

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