超声萃取-气相色谱法测定黄瓜中残留的百菌清和毒死蜱

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(浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014)

黄瓜是人们日常生活中最为普遍的蔬菜，但是随着需求量的增加，农药的使用量也在逐年增加,农药的大量使用导致了严重的环境污染和生态破坏[1-2].百菌清(CHT)和毒死蜱(CHP)是当下使用的较多的杀菌、杀虫剂，我国陕西、江苏省份相继出现了果蔬农残超标问题[3-4]，随着果蔬农残问题的报道增多，果蔬的农药残留问题也逐渐被人们所重视.我国食品安全国家标准GB 2763—2012《食品中农药最大残留限量》规定黄瓜中百菌清最大残留限量为5 mg/kg，ADI(每日允许摄入量)为0.02 mg/kg，毒死蜱最大残留限量为0.1 mg/kg，ADI(每日允许摄入量)为0.01 mg/kg[5].超声萃取法(Ultrasonication extraction)不仅安全、快速，而且高效、廉价，在处理多个领域物质提取都有很好的应用[6-8].超声萃取法在处理果蔬农药提取中是一种比较理想的提取方式.利用有机溶剂正己烷、丙酮作为萃取剂单独提取黄瓜中农药，效果不理想[9].Raymond等[10]提取蔓越莓植株中的百菌清和毒死蜱时，采用了正己烷与丙酮的混合溶液，农药的萃取效率达到95%以上.在黄瓜萃取液中含有大量叶绿素和植物酶，这些干扰物质会影响农药的检测，使得农药的回收率过高，而且也会对气相色谱仪造成严重的污染[11-12].

传统的层析柱填料主要有活性炭、氧化铝、石墨化炭黑、硅胶和硅藻土等，有研究指出：利用活性炭和石墨化炭黑来去除萃取液中的叶绿素效果比较明显，但是有机氯农药回收率较低[13-14].本实验提出了超声波萃取，正己烷-丙酮混合液提取、层析柱分离的气相色谱方法，能快速、准确地测定黄瓜中百菌清和毒死蜱的残留量.

1 材料与方法

1.1 仪 器

气相色谱仪(Agilent，7890A)、旋转蒸发仪(Buchi，R-215)、超声振荡仪(上海科导超声仪器有限公司，SK3200H)、循环式多用真空泵(河南太康科技器材厂，SHB-111A)、分析天平(德国赛多利斯，BS224s)、离心机.

1.2 试验材料与试剂

标准品百菌清和毒死蜱均购于Dr.Ehrenstrofer公司，纯度均≥99.99%；中性三氧化二铝，75～150 μm；弗罗里硅土，150～250 μm；层析柱规格为20 cm×1 cm(内径)；分析纯正己烷、丙酮、无水硫酸钠；哇哈哈矿泉水(杭州公司)；黄瓜购买于农贸市场，实验之前已经检测百菌清和毒死蜱在黄瓜中的本底含量.

1.3 提取方法

黄瓜样品(皮和肉):分别称取10 g黄瓜皮和肉，分别放入研钵中，加入无水硫酸钠5 g，研磨，然后转移至100 mL具塞锥形瓶中，并用50 mLV(正己烷)∶V(丙酮)=60∶40混合溶剂清洗研钵，然后直接将溶剂倒入锥形瓶中，超声萃取30 min后将萃取液转移至250 mL圆底烧瓶；超声萃取过程重复两次，最后将两次萃取液水浴(45 ℃)旋转蒸发浓缩至1～2 mL，待净化.

1.4 净化方法

净化(黄瓜样品)：将旋蒸后待净化样品加入层析柱中，填料从上至下为：适量无水硫酸钠、5 cm硅胶、1 cm氧化铝，用胶头滴管将V(正己烷)∶V(丙酮)=90∶10混合淋洗液加入层析柱中进行洗脱，并收集前20 mL洗脱液定容至25 mL，上机待测.

1.5 色谱分析条件

将净化定容之后的待测样品进气相色谱仪检测分析.色谱柱型号为HP-5(30 m×0.320 mm×0.25 mm)；Ni63电子捕获检测器(ECD)；升温程序：起始温度为80 ℃，保持2 min，然后以10 ℃的速度升温至280 ℃，保持5 min，进样口和检测器温度分别为250 ℃和300 ℃；载气为高纯度氦气(纯度≥99.999%)，流速为1.0 mL/min；不分流进样，进样量为1 μL.

2 结果和讨论

2.1 黄瓜中百菌清和毒死蜱的提取

添加百菌清、毒死蜱两种农药标准品到黄瓜样品中，用V(正己烷)∶V(丙酮)=60∶40混合溶剂50 mL为萃取剂，分别超声萃取15，30，60 min，萃取两次，结果(表1)表明：超声萃取60 min，两次之后回收率偏高，可能提取出更多杂质干扰标样；而超声15 min，两次萃取之后回收率偏低，萃取时间不够，不能完全提取出两种农药；然而超声萃取30 min，两次之后能够达到96%以上的农药萃取效率，这与Raymond等[10,15]提取蔓越莓植株中的百菌清和毒死蜱的方法效率接近.所以最后我们选择超声萃取时间为30 min，萃取两次.

表1 黄瓜样品不同超声萃取时间的回收率比较

2.2 黄瓜样品净化方法比较

为了最大效率去除萃取液中的叶绿素和植物酶等干扰物质，本实验主要利用活性氧化铝、硅胶和无水硫酸钠三种物质组合作为层析柱填料(其中无水硫酸钠主要用来去除萃取液中多余水分).固定硅胶量和层析柱的直径(1 cm)，改变氧化铝的填充量，并用V(正己烷)∶V(丙酮)=90∶10的混合洗脱液洗脱萃取液，测定不同氧化铝用量对百菌清和毒死蜱回收率的影响，实验结果列于表2中.从表2可以看出：随着氧化铝填料高度的增加，百菌清和毒死蜱两种农药的回收率均显著下降.而硅胶和氧化铝填料高度分别为5 cm和1 cm时，两种农药回收率能满足农残检测的要求.确定本实验中农药的净化层析柱填料从上至下为：适量无水硫酸钠、5 cm硅胶、1 cm氧化铝.

表2 层析柱中最佳填料比例

按照以上填料要求填充层析柱之后，该选用何种淋洗液也是我们需要解决的问题之一.单一使用正己烷、丙酮或者乙酸乙酯等试剂进行洗脱，农药的分离效果不明显，而用V(正己烷)∶V(丙酮)=90∶10的淋洗液对分离百菌清、毒死蜱有很好的效果[16]，实验采用该混合溶液25 mL作为淋洗液，接取、定容至25 mL后气相色谱法测定.百菌清和毒死蜱的回收率良好，分别能达到102%和98%，与传统方法比较有了更好的效果[10,17].

2.3 回收率实验

依据以上实验设计对黄瓜和农药洗脱液中百菌清和毒死蜱进行加标回收率实验，分别称取五份10 g黄瓜皮和肉，分别加入1 mL和1 mg/L农药标准品.测定加标回收率，结果见表3.毒死蜱在黄瓜皮和肉中的平均回收率分别为104.1%和96.5%；百菌清在黄瓜皮和肉中的平均回收率分别为95.1%和92.5%.

表3 百菌清和毒死蜱在黄瓜皮和肉中回收率(n=5)

2.4 标准曲线、最低检出限

取一定量的10 mg/L百菌清毒死蜱标准溶液，分别稀释成80，160，240，320，400 μg/L五种不同质量浓度的标准溶液，振荡摇匀，按照气相色谱仪检测条件，以峰面积对标准物质量做标准曲线，检测百菌清和毒死蜱标准样品得到的线性回归方程分别为Y2=41.8x+456.8和Y1=72.04x+2 996，线性范围为80～400 μg/L，相关系数R2分别为0.999和0.998(图1)，满足常规分析.将百菌清和毒死蜱标准样品逐级稀释到峰高为基线噪音的3倍时，该质量浓度为最低检出质量浓度，值分别为28 μg/L和33 μg/L.

图1 百菌清和毒死蜱标准曲线图

图2 百菌清、毒死蜱标准品及其在黄瓜中的气相色谱图

2.5 气相色谱图

对比了百菌清和毒死蜱标准图谱和实测样品图谱情况，图2(a)为百菌清和毒死蜱均为50 μg/L的标准溶液，图2(b)为10 g黄瓜中加入百菌清和毒死蜱标准(0.05 μg).标准图谱中，百菌清和毒死蜱出峰时间分别为9.438和10.597，在同样的色谱条件下，黄瓜样品中两种农药出峰时间分别为9.452和10.611，CHT和CHP两种农药样品的保留时间比标准品的保留时间延迟0.014 min，这可能是由于标准品和农药样品中溶剂的差异或者仪器的稳定性而导致两种农药的出峰时间存在微小的差异.一般情况下，两者差异控制在1%以内则可以认为是同一种物质.因此综合分析，二者的出峰时间基本一致，能够达到实验的定性要求.

3 结 论

建立了一种采用超声萃取，利用复合填料层析柱高效去除叶绿素的干扰，最后经过气相色谱法测定样品中的目标物的检测方法，得到黄瓜中百菌清和毒死蜱的平均回收率，分别为92.5%～95.1%和96.5%～104%，检测限分别为28 μg/L和33 μg/L，质量浓度在80～400μg/L范围线性关系良好，线性回归系数分别为0.999和0.998.检测方法能够同时检测黄瓜中的百菌清和毒死蜱，与单一目标物国标测定法比较，该方法快速、灵敏、准确.本研究为黄瓜中百菌清和毒死蜱两种农药的检测提供了一种操作简便，溶剂消耗量少，能够批量操作，对环境污染少的分析方法.

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