脱氢紫堇碱对内毒素血症大鼠心肌NF-κB和SOD、MDA的影响*

周晶晶 黄小民 蒋旭宏△ 李 杏

（1.浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310006）

脱氢紫堇碱对内毒素血症大鼠心肌NF-κB和SOD、MDA的影响*

周晶晶1黄小民1蒋旭宏1△李 杏2

（1.浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310006）

目的 观察脱氢紫堇碱（DHC）对内毒素血症大鼠心肌核因子-κB（NF-κB）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影响，探讨DHC对内毒素血症大鼠心肌损伤的保护作用及其机制。方法 采用直接尾静脉注射内毒素的方法建立大鼠内毒素血症心肌损伤模型，50只Wistar大鼠随机分成5组：NS对照组、LPS模型组、DHC低剂量组、DHC中剂量组、DHC高剂量组。采用比色法检测血清SOD含量、TBA法测定血清含量，免疫组化组检测心肌组织NF-κB的表达。结果 LPS模型组大鼠血清SOD含量明显减低，而MDA含量明显增高，心肌组织中NF-κB蛋白水平明显增高，与NS对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；予DHC干预后，DHC低、中剂量组可明显使降低的SOD活性升高，而高剂量组与LPS模型组差异无统计学意义（P＞0.05）；DHC各剂量组可明显降低血清MDA含量，与LPS模型组相近（P＜0.01）；DHC各剂量组大鼠心肌组织NF-κB蛋白水平明显下降，与LPS模型组比较差异明显（P＜0.01）。结论 DHC可以通过降低内毒素血症大鼠心肌组织内NF-κB活性和提高大鼠抗氧化能力，对心肌产生保护作用。

内毒素血症 脱氢紫堇碱 NF-κB SOD MDA

内毒素血症通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。脱氢紫堇碱（DHC）是中药延胡索块茎中的有效提取物，临床常用于心血管疾病的治疗。笔者既往研究发现内毒素血症早期即可出现心肌损伤，而DHC对其炎症反应有明显抑制作用，可以保护受损的心肌组织。本研究拟进一步观察DHC对内毒素血症大鼠核因子-κB（NF-κB）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的影响，从而探讨DHC对内毒素大鼠心肌损伤保护机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 清洁级雄性Wistar大鼠50只由浙江中医药大学实验动物中心提供，体质量200～220 g，SPF级。脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司试剂，批号：H20055058；DHC为大连美仑生物技术有限公司产品，批号：20120510；SOD （批号：20130622）、MDA （批号：20130406）检测试剂盒购自南京建成生物有限公司；NF-κB p65抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学两步法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒（ZLI-9032）为北京中杉金桥公司产品。

1.2 造模及给药 50只Wistar大鼠在实验室分笼饲养1周，室温维持25℃，自由进食、饮水。以随机数字表法将大鼠分为5组：NS对照组、LPS模型组、DHC低、中、高（2.5、5、10 mg/kg）剂量组，每组 10 只。 LPS 模型组和DHC低、中、高剂量组大鼠分别经尾静脉注入内毒素5 mg/kg，NS对照组给予等容积生理盐水。在静脉注完内毒素后，DHC低、中、高剂量组大鼠再经尾静脉分别注入DHC溶液2.5、5、10 mg/kg。NS对照组、LPS模型组给予等容积生理盐水，方法同DHC干预组。

1.3 标本采集与检测 给药1 h后予25%的水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清，采用比色法检测血清SOD含量、TBA法测定血清含量，操作严格按照试剂盒说明书；取左心室心肌组织，以10%甲醛固定，NF-κB的蛋白表达检测采用免疫组化法两步法，心肌组织石蜡切片经常规脱蜡至水，高压热修复后予3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育 60 min；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育 60 min；PBS洗 5 min×3次；DAB显色、复染、脱水透明后封片。阳性者表现为心肌胞浆内棕黄色颗粒沉积，染色完成后，进行400倍的显微照相和MetaMorph/BX41型图象数据分析系统测定积分吸光度，进行数据分析。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，各组均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清SOD、MDA含量比较 见表1。LPS模型组大鼠血清SOD含量明显减低，而MDA含量明显增高，与NS对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；DHC低、中剂量组SOD水平升高，而高剂量组与LPS模型组相近；DHC各剂量组血清MDA含量均明显降低，与LPS模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 各组大鼠心肌组织NF-κB的表达比较 见表1，图1。LPS模型组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白水平明显增高，与NS对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而DHC低、中、高剂量均能使心肌组织中NF-κB蛋白水平明显下降，与LPS模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

表 1 血清 SOD、MDA、含量变化（±s）

表 1 血清 SOD、MDA、含量变化（±s）

与LPS模型组比较，*P＜0.01。

组 别 n NF-κB（MOD）NS对照组 10 0.16±0.060*LPS模型组 10 0.35±0.014 DHC 低剂量组 10 0.26±0.010*SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）179.41±4.82* 3.29±0.34*136.88±4.27 7.04±0.21 158.73±3.45* 4.85±0.43*DHC 中剂量组 10 0.22±0.015*165.58±6.25* 4.37±0.34*DHC 高剂量组 10 135.88±2.34 6.33±0.19* 0.31±0.023*

图1 各组大鼠心肌组织NF-κB的表达

3 讨 论

近年来，大量研究表明氧化应激是导致心血管系统结构功能异常的重要原因之一。内毒素血症过程中，单核巨噬细胞在收到病原体刺激后，产生呼吸爆发，可以产生大量活性氧（ROS）。ROS是指由氧化还原反应产生，具有化学性质活泼的含氧功能基团的化合物，其参与生成ONOO-及 H2O2，ONOO-可激活核聚酶聚合酶，从而造成心肌收缩力的下降［1］。MDA是机体脂质过氧化代谢的毒性产物，是判断自由基损伤的重要指标。测定组织MDA含量可估计组织脂质过氧化损伤程度和氧自由基的生成情况，而SOD是体内最重要的自由基清除剂之一，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，消除体内自由基链式反应对机体的损害，减轻自由基链式反应对机体的损害。NF-κB是一类能与多种基因启动子部位的κB位点特异结合，并促进转录的蛋白质总称，静息状态下通过I-κB紧密结合以无活性的形成存在于细胞浆中，对细胞的生长、分化、黏附、凋亡及炎症反应等具有十分重要的调节作用［2］，NF-κB是第一个被证明能被ROS激活的真核细胞转录因子，并且两者之间存在正反馈效应［3］。内毒素血症发生时，NF-κB亦能被LPS刺激激活，刺激信号可使I-κB磷酸化，从而与NF-κB解离，研究显示LPS刺激后可在1h内引起NF-κB的大量激活［4-5］，激活后的NF-κB能诱导表达血管内皮细胞黏附分子和肿瘤坏死因子，这些细胞因子可直接引起血管内皮细胞和心肌细胞的损伤。

本研究采用尾静脉注射LPS建立内毒素血症大鼠模型，不同剂量DHC进行干预，研究结果显示，DHC低、中、高各剂量均可明显降低血清MDA含量，降低心肌组织中NF-κB含量，与模型组相比差异明显（P＜0.01），中、高剂量DHC可显著升高SOD活性，而高剂量组与模型组水平相近。因此笔者认为DHC可能是通过降低大鼠氧化应激，增加SOD活性，保护自由基清除系统，减轻脂质过氧化反应及有害代谢产物对心肌细胞的损伤，并且联合调控NF-κB活化，降低NF-κB活性，抑制细胞因子激活，从而减轻炎症反应，减轻细胞因子对心肌细胞的损伤，达到对内毒血症大鼠心肌保护作用。

［1］Francisco G Soriano，Antonio C．Nogueira，et al.Potential role of poly （adenosine 5′-diphosphate-ribose）polymerase activation in the pathogenesis of myocardial contractile dysfunction associated with human septic shock［J］．Crit Care Med，2006，34（8）：1073-1079.

［2］Clermonte，vrgelyc V，Girard C，et al.Cellula rinjury accoiated with extracorporeal circulation［J］.Ann Catdiol Angeiol（Paris），2002，51（12）：3843-3846.

［3］游琪，蔡久英.氧化应激与心肌损伤的研究进展［J］.临床荟萃，2005，20（19）：1127-1128.

［4］罗斌，张斌，何韵，等.大鼠急性心肌缺血后心肌NF-kB的检测及其法医学意义［J］.中国法医杂志，2005，20（5）：257-259.

［5］Han SJ，Ko HM，Choi JH，et a1．Molecular mechanisms for lipepelys accharide-induced biphasie activation of nuclear factor-kappa B （NFKB）［J］．J Biol Chem，2002，277（47）：44715-44721．

Influence of Dehydeocorydaline on the Expression of NF-κB，SOD，and MDA in Myocardium of Rats with Endotoxemia

ZHOU Jingjing，HUANG Xiaomin，JIANG Xuhong，et al.The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University，Zhejiang，Hangzhou310006，China

Objective:To study the influence of dehydeocorydaline on the expression of NF-κB，SOD，and MDA in myocardium rats with endotoxemia，and to investigate protective mechanism of DHC on myocardial injury model．Methods： Tail intravenous injection of endotoxin was used to establish myocardial injury model in rats with endotoxemia.50 male Wistar rats were randomly divided into 5 groups:NS control group，LPS model group，DHC low dose group，DHC medium dose group，and DHC high dose group.Colorimetry was applied to detect the contents of serum SOD，Total Bile Acids method to detect the content of serum MDA，and immunohistochemical SP method to detect myocardial tissue NF-κB.Results： Serum SOD content in LPS model group significantly reduced，MDA content obviously increased，and NF-κB protein levels in myocardial tissue significantly increased.Compared with NS control group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.After DHC intervention，activities of SOD in DHC low，middle dose groups obviously increased，but difference of high dose group had no statistical significance with that of LPS model group.Serum MDA content obviously reduced in each DHC dose group，and there were significant differences compared with LPS model group （P＜0.01）.NF-κB protein levels in each DHC dose group significantly decreased.Compared with LPS model group，the difference was statistically significant （P＜0.01）.Conclusion： DHC can reduce activity of NF-κB in myocardial tissue of rats with endotoxemia and improve the antioxidant ability to protect myocardium.

Endotoxemia；Dehydeocorydaline；NF-κB；SOD；MDA

R285.5

A

1004-745X（2014）07-1231-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.009

浙江省中医药管理局项目（2011za034）

△通信作者

2014-04-08）