搜风祛痰法对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块HO-1和TLR4表达的影响*

魏伟超 宫丽鸿 安 毅

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110000；2辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110000）

搜风祛痰法对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块HO-1和TLR4表达的影响*

魏伟超1宫丽鸿2安 毅1

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110000；2辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110000）

目的 观察搜风祛痰中药复方稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化（AS）不稳定斑块动物模型的影响。方法 6～8周龄ApoE基因敲除小鼠制备AS不稳定斑块模型，分别给予阿托伐他汀以及不同剂量稳斑汤干预1个月，正常组采用生理盐水灌胃1个月。取小鼠主动脉组织HE染色进行病理学观察，并采用免疫组化和RT-PCR技术检测HO-1和TLR4的表达水平。结果 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1的表达水平治疗组明显高于对照组（P＜0.01），各组小鼠腹主动脉组织中TLR4的表达水平治疗组明显低于对照组（P＜0.01）。结论 Apo E基因敲除小鼠 AS不稳定斑块的形成与炎症因子密切相关，搜风祛痰中药复方稳斑汤可能通过调节HO-1和TLR4的表达而干预AS斑块形成及破裂。

痰风理论论治 ApoE基因敲除小鼠 AS 不稳定斑块 HO-1 TLR4

现今心血管疾病导致全球总死亡的比例从1/10上升到1/3。动脉粥样硬化（AS）斑块破裂是急性心脑血管事件的重要危险因子，炎症能改变斑块性质，改变其稳定性。近来发现，血红素是一种强致氧化物，能诱导细胞内氧化反应。血红素氧合酶（HO）是血红素降解的起始酶和限速酶，HO-1氧化分解血红素产生内源性一氧化碳（CO），胆绿素和游离铁，具有强大的抗氧化作用。研究发现CO同NO功能相似，能激活可溶性鸟苷酸环化酶，增加环磷酸鸟苷（cGMP）的生成，舒张血管平滑肌［1］，还能抑制单核细胞及血小板向内皮的黏附聚集、抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移［2］。TOLL样受体4（TLR4）的过度表达可诱发炎性反应，促进AS斑块形成及破裂。搜风祛痰中药复方在临床上广泛用于AS的治疗，效果显著，然而其作用机理仍未阐明。本实验以ApoE基因敲除小鼠为研究对象，通过高脂饲养造出AS不稳定斑块模型，并给搜风祛痰中药复方稳斑汤干预，研究斑块中的HO-1、TLR4表达情况，以推测其在斑块形成及破裂中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄Apo E基因缺陷鼠 （系C57BL/6 J，北京大学实验动物中心美国Jackson实验室引进并培育成功）70只，SPF级，体质量18～20 g。

1.2 药物 选用稳斑汤，药物组成：全蝎10 g，蜈蚣2条，地龙 15 g，陈皮 15 g，法半夏 15 g，白术 15 g，水蛭15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2 g/mL的中药浓缩液备用。

1.3 试剂和仪器 HO-1，TLR4一抗及相对应二抗（北京博奥森生物科技有限公司）。SP试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司）。DAB显色试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司）。两步法RT-PCR试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。

1.4 模型制备 高脂饲料（含0.15%胆固醇）喂养13周后，随机处死4只，取主动脉根部，HE染色观察AS硬化程度，确定造模成功。

1.5 分组及给药 Apo E基因敲除小鼠60只随机分为模型组、稳斑汤低剂量组、稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组及西药组，每组12只。根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体质量折算系数9.0折算成小鼠用量。稳斑汤低剂量组 61.75 g/（kg·d），稳斑汤中剂量组 123.5 g/（kg·d），稳斑汤高剂量组247 g/（kg·d）， 西药组予阿托伐他汀 0.27 g/（kg·d），模型组给予生理盐水0.3 mL/d。按体质量系数比折算成小鼠用量灌胃给药，每日1次。各组干预时间为1周。另取正常C57BL/6 J小鼠12只正常饲料喂养13周，设为空白组。取材前夜禁食，经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分离血清，-80℃冻存用作测定血清HO-1、TLR4水平。处死全部小鼠，无菌条件下取出心脏及主动脉，心脏10%甲醛固定，主动脉放在冻存管内液氮骤冷保存。

1.6 观察指标 （1）主动脉组织病理学观察。每组随机取5只小鼠，麻醉处死，无菌条件下在每只小鼠的主动脉根部取4个相同的切面。切面分别为：升主动脉近端横截面，切面形态呈圆形；主动脉瓣附着部位，并有冠状动脉开口；主动脉瓣起始横截面；主动脉瓣完全出现并汇合在一起。取材后用生理盐水冲洗，10%甲醛中性溶液固定。常规石蜡包埋，均匀间断切片，厚5 μm。①HE染色：普通光镜下观察主动脉根部组织及斑块的形态结构。②Masson染色：普通光镜下观察各斑块中纤维成分的分布。（2）用计算机彩色图像处理系统测量血管内膜厚度，斑块面积，管腔面积，脂质核心面积，斑块中除胶原和纤维成分以外的斑块面积，最小纤维帽厚度。①免疫组织化学检测：采用SP法，常规滴加一抗，二抗，DAB显色苏木精复染，高倍视野下计数浸润于内膜的单核细胞数。以染色系数统计HO-1免疫组化染色结果。②实时定量RT-PCR检测：先提取总RNA，然后取4 μL总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20 μL体系，42℃15 min，95℃，2 min反转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR反应，分别对小鼠HO-1，TLR4的表达进行测定。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较用t检验，多组均数比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠形态学改变的比较 各组小鼠腹主动脉HE染色形态学改变见图1。空白对照组：动脉内膜附有一层内皮细胞，内皮细胞层呈现皱褶状排列，但排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎性细胞。模型对照组：血管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现，斑块表面附有纤维帽，纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织构成，斑块中央可见大量的脂质聚集，斑块内可见大量泡沫细胞，偶见炎性细胞浸润；未出现斑块的动脉内膜区域严重破损。稳斑汤低剂量组：血管腔内可见粥样硬化斑块，斑块面积明显小于模型对照组，斑块内脂质含量较模型组少，斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞；未出现斑块的动脉内膜区域形态较为完整，偶见内膜残缺。稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量、西药组：动脉内膜大部分较为光滑，偶见内膜不全，内膜不全区域可见明显的脂质条纹块形成，偶见泡沫细胞聚集，有少量纤维成分交联。2.2 各组小鼠HO-1表达水平比较 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1表达主要在血管内皮细胞 （EC）、泡沫细胞及血管平滑肌细胞（VSMC）内，以含棕褐色颗粒的细胞为HO-1蛋白表达的阳性细胞，见图2。空白对照组阳性细胞主要分布于内膜，HO-1蛋白表达在EC内；模型组HO-1蛋白表达明显降低，偶见弱阳性表达；稳斑汤低、中、高剂量组及西药组表达水平显著升高，广泛表达于EC、VSMC及斑块的泡沫细胞内。

图1 光镜下各组小鼠腹主动脉根部组织及斑块的形态结构改变（HE染色，100倍）

图2 各组小鼠复制动脉组织中HO-1表达（免疫组化，DAB显色，400倍）

各组小鼠腹主动脉组织中HO-1表达水平见表1、表2和图3。Apo E-小鼠的免疫组化结果表明，搜风祛痰中药复方稳斑汤和阿托伐他汀均能提高斑块内HO-1的阳性表达（P＜0.01）。

表1 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1蛋白表达水平（±s）

表1 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1蛋白表达水平（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n空白对照组 5模型对照组 5稳斑汤低剂量组 5 HO-1蛋白0.265±0.009 0.199±0.011**0.283±0.009**△△稳斑汤中剂量组 5 0.310±0.010**△△稳斑汤高剂量组 5 0.317±0.012**△△西药组 5 0.315±0.008**△△

2.3 各组小鼠TLR-4表达水平比较 见表3，图4。Apo E-小鼠的RT-PCR结果表明，搜风祛痰中药复方稳斑汤和阿托伐他汀均能降低各组小鼠腹主动脉组织中TLR-4 mRNA表达水平（P＜0.01）。

表2 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1 mRNA表达水平（±s）

表2 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1 mRNA表达水平（±s）

组 别 n空白对照组 5模型对照组 5稳斑汤低剂量组 5 HO-1 mRNA 0.270±0.024 0.227±0.022*0.290±0.037△△稳斑汤中剂量组 5 0.318±0.029*△△稳斑汤高剂量组 5 0.367±0.041**△△西药组 5 0.385±0.033**△△

图3 各组小鼠腹主动脉组织中HO-1 mRNA表达电泳图

表3 各组小鼠腹主动脉组织中TLR-4 mRNA表达水平（±s）

表3 各组小鼠腹主动脉组织中TLR-4 mRNA表达水平（±s）

组 别 n空白对照组 5模型对照组 5稳斑汤低剂量组 5 TLR-4 mRNA 0.280±0.026 0.323±0.020**0.270±0.026△稳斑汤中剂量组 5 0.243±0.013*△稳斑汤高剂量组 5 0.209±0.021**△△西药组 5 0.213±0.020**△△

图4 各组小鼠腹主动脉组织中TLR4-1 mRNA表达电泳图

3 讨 论

Apo E基因缺陷小鼠在普通饲料饲养条件下能自发形成高脂血症和动脉粥样硬化，其动脉粥样硬化发展包括脂质条纹到有纤维帽覆盖的成熟斑块等各个阶段，与人类AS斑块类似，因而是目前研究AS斑块较为理想的动物模型［3］。局部炎症细胞的浸润以及全身性炎症是导致易损斑块溃疡、破裂导致血栓形成，是临床AS发病的主要病理学基础［4］。大量研究认为易损斑块主要具有以下特点：巨大的脂质中心，局部的慢性炎症反应，巨噬细胞增多、活化，破损部位T淋巴细胞聚集，平滑肌细胞数量减少以及纤维帽薄弱，胶原成分减少［5］。本实验结果显示，经高脂饮食喂养26周后，主动脉根部AS斑块呈现易损斑块的病理形态学特征。AS是一个复杂的病理进展过程，其发病机制至今尚未完全明了，其与内皮细胞受损、平滑肌细胞增殖、炎症细胞浸润等因素密切相关［6-7］。近年研究表明动管腔阻塞不是由于斑块无限制增长，而是由于斑块破裂和血栓形成这一急性事件所致。HO是血红素降解的起始酶和限速酶［8］。HO-1为诱导型HO，是其中最重要的一种酶，具有强大的抗炎及调节免疫作用，对心血管系统有保护作用。此外，HO-1氧化分解血红素产生内源性一氧化碳（CO），具有很强的抗氧化作用，可舒张血管平滑肌，参与循环系统的调节，并有抑制单核细胞及血小板向内皮的黏附聚集、抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移等方面的作用［9］。TLR主要存在于免疫系统，在细胞活化信号的转导信号中起重要作用，能辨别不同类型病原体并激活快速的自身免疫反应；近年来发现在心血管系统中也有广泛表达［10］。研究发现，TLR4的识别功能可激活NF-κB进而导致一系列炎症细胞因子的合成与释放诱发炎症反应。TLR4促进oxLDL介导动脉粥样硬化，充当细菌感染与动脉粥样硬化形成的一个桥梁［11］，与内皮细胞功能受损促进动脉粥样硬化形成有关［12］，总之TLR4与动脉硬化的形成、进展、斑块不稳定乃至破裂密切相关。

中医学认为胸痹总属阳微阴弦，气虚推动无力，水液聚而生痰湿，痰为阴邪，易阻气机而致瘀；痰湿日久易化热，痰、瘀、热三者相互促生，交结为患，日久不化，酿成浊脂，浸于脉管。《医学心悟》曰“其人脏腑素有郁热，则风乘火势，火借风威，热风悱郁不得宣泄，而为热风矣”。热风既成，热则灼血成瘀，炼液成痰，风则引邪肆虐，流窜脏腑。《东医宝鉴》也指出“痰者，津液因热而成，热则津液熏蒸而为胸痹心痛”。

本实验选用复方稳斑汤，方中全蝎、蜈蚣息风止痉、解毒散结，蜈蚣兼能通络止痛；地龙清热息风、平喘通络止痉，共为君药。陈皮、半夏、白术合用，既能燥湿化痰又可宽胸理气、消痞散结，为臣药；水蛭为虫类活血药、破血逐瘀，为佐药。合方共奏搜风祛瘀通络之功效。风为百病之长，其性善行而数变；痰为百病之祟。风药善于宣畅气机疏通血络，消除瘀滞，尤其虫类风药更以行走攻窜见长，善疏通经络壅滞，开启孔窍闭塞，故能通利心络，开通心窍，善止痹痛。本研究结果表明搜风祛痰中药复方稳斑汤能有效干预动脉粥样硬化斑块的形成及破裂，其可能通过调节HO-1和TLR4的表达发挥作用。

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Study of Soufengqutan Method on Expression of Unstable Plaque HO-1 and TLR4 in ApoE Gene Knockout Rats with Atherosclerosis

WEI Weichao1，GONG Lihong2，AN Yi1.1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang110000，China；2Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang110000，China

Objective:To observe the effect ofCompound Soufengqutanwenban Decoctionon unstable plaque in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis.Methods:6 to 8 weeks old ApoE gene-deficient rats were selected to establish AS unstable plaque model，and then they were given low dose，medium-dose，high-dose Chinese herbal compound and western medicine for a month.At the same time，the model group was fed by normal saline for one month.Then aortic tissue was observed under optical microscope pathology after HE staining.And then levels of HO-1 and TLR4 were detected by immunohistochemistry and RT-PCR technique.Results:HO-1 expression levels in aortic tissue of rats in treatment groups was significantly higher than those in control group （P＜0.01）.TLR4 expression level of abdominal aortic tissue in treatment groups were significantly lower than those in control group （P＜0.01）.Conclusion:Unstable plaque formation of ApoE gene knockout rats with AS is closely related to inflammatory cytokines.Compound Soufengqutanwenban Decoctionmay stabilize plaques by regulating the expression of inflammatory factors and interfering the formation and rupture of AS plaque，which provides a new idea to prevent AS.

Phlegm-wind theory treatment；ApoE gene knockout rats；AS；Unstable plaque；HO-1；TLR4

R285.5

A

1004-745X（2014）07-1218-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.004

中国博士后科学基金资助项目（20110491540）

2014-04-01）