电针丰隆穴对高脂血症大鼠腹腔巨噬细胞MCP-1、IL-1γ 表达的影响*

田佳玉 陈盈芳 王 琼 肖 颖 乐 薇 张红星（湖北省武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022）

电针丰隆穴对高脂血症大鼠腹腔巨噬细胞MCP-1、IL-1γ 表达的影响*

田佳玉 陈盈芳 王 琼 肖 颖 乐 薇 张红星△（湖北省武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022）

目的 观察电针丰隆穴对高脂血症大鼠单核趋化因子（MCP-1）、白细胞介素1γ（IL-1γ）含量的影响。方法 将40只健康SD大鼠随机分为正常对照组、高脂饲料组、高脂+普通饲料组、高脂饲料治疗组及高脂+普通饲料治疗组，每组8只。正常组喂普通饲料，其余4组采用高脂饮食饲料饲喂法建立高脂血症大鼠模型，造模28 d后，高脂+普通饲料组、高脂+普通饲料治疗组改用普通饲料喂养，其余3组饲喂方法不变，同时高脂饲料治疗组及高脂+普通饲料治疗组电针丰隆穴，疏密波，频率为2/100 Hz，电流强度2 mA，治疗30 min，每日1次，连续治疗28 d。治疗结束后，检测各组大鼠血脂水平，即总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量，流式细胞术（FCM）及酶联免疫吸附法（ELASA）检测各组大鼠腹腔巨噬细胞中单核趋化因子（MCP-1）、白细胞介素1γ（IL-1γ）的表达。结果 高脂饲料组大鼠血浆TC、LDL-C与正常对照组相比明显上升（P＜0.01）；高脂+普通饲料组大鼠血浆TC、LDL-C与高脂饲料组相比较明显下降（P＜0.01），较正常对照组仍明显升高（P＜0.01）；电针丰隆穴治疗后，高脂饲料治疗组与高脂饲料组相比较，TC和LDL-C明显降低（P＜0.01），高脂+普通饲料治疗组大鼠血浆中TC、LDL-C与高脂+普通饲料组相比较，明显降低（P＜0.01）。高脂饲料组大鼠腹腔巨噬细胞、MCP-1及IL-1γ的表达较正常对照组显著升高（P＜0.01）；高脂+普通饲料组大鼠腹腔巨噬细胞、MCP-1及IL-1γ的表达较高脂饲料组明显下降（P＜0.05），但仍较正常组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；高脂+普通饲料治疗组大鼠腹腔巨噬细胞、MCP-1及IL-1γ的表达较高脂饲料治疗组显著下降（P＜0.01）。结论 电针丰隆穴能够明显下调高脂血症大鼠巨噬细胞、MCP-1、IL-1γ的表达，对高脂血症具有一定的治疗作用。

高脂血症 电针 丰隆穴 巨噬细胞 单核趋化因子1 白细胞介素1γ

高脂血症是常见的代谢与内分泌疾病，同时也是动脉粥样硬化（AS）、冠心病（CHD）等相关疾病的病理基础，发病率呈逐年上升的趋势，严重影响人类身体健康［1］。另外，它与心脑血管、肾脏疾病的发病率、死亡率之间存在着明显的相关性。目前对高脂血症的治疗，临床上主要采用他汀类、贝特类、烟酸类及树脂类等调脂药物，其调脂作用、力度各不相同，且容易引起肝、肾损害等不良反应［2］。大量的临床研究表明，针刺作为非药物疗法治疗高脂血症有着无法替代的治疗效果［3］。本研究通过观察电针高脂血症大鼠的丰隆穴，对其腹腔巨噬细胞、巨噬细胞内单核趋化因子（MCP-1）、白细胞介素1γ（IL-1γ）含量的影响，进一步明确电针在治疗高脂血症中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康SD大鼠40只，雄性，体质量180～200 g，由武汉大学实验动物中心提供，动物合格证号［SCXK（鄂）2008-0004］。根据随机数字表将40只SD大鼠随机分为5组，每组8只大鼠，即正常对照组、高脂饲料组、高脂饲料治疗组、高脂+普通饲料组及高脂+普通饲料治疗组。

1.2 主要药品与仪器 流式细胞仪（美国ABI公司），抗大鼠CD11 b-PERCP单克隆抗体 （美国eBioscience公司），抗大鼠MCP-1-PE单克隆抗体 （美国eBioscience公司），1640培养液，PBS缓冲液（美国HyClone公司），Ionomycin，莫能霉素（美国 ENZO 公司），PMA，皂苷 （美国Amresco公司），0.1%BSA （瑞士Roche公司），多聚甲醛 （美国SIGMA公司），大鼠白介素1γ（IL-1γ）ELISA试剂盒（伊莱瑞特公司），全自动酶标仪 （Thermo scientific实验室），LH202H型韩氏穴位神经刺激仪（北京华威有限公司），型号S3210 32号1寸健卫士牌不锈钢针灸针 （中美合作泰成科技发展有限公司）。

1.3 动物造模 正常对照组大鼠用普通大鼠饲料自然喂养，其余4组大鼠用高脂饲料喂养，饲料组成：猪油10%，蛋黄粉5%，胆固醇1%，丙基硫氧嘧啶0.2%，脱氧胆酸钠0.5%，蔗糖5%，基础饲料78.3%［4］。喂养28 d后，其中高脂+普通饲料组及高脂+普通饲料治疗组换成普通饲料喂养，同时对高脂饲料治疗组及高脂+普通饲料治疗组大鼠进行电针丰隆穴治疗。

1.4 治疗方法 取穴参照《实验针灸学》［5］，模拟人体经穴定位后，选取大鼠双侧丰隆穴。丰隆穴在大鼠膝关节外侧后三里下1 mm，腓骨小头下约5 mm处。用1寸针灸针，对丰隆穴直刺7 mm，快速捻转至针下有沉涩感后，接韩式穴位神经刺激仪，调至等幅疏密波，频率为2/100 Hz，电流强度2 mA，以大鼠肢体微颤为度，每次治疗时间为30 min，每日1次，连续治疗28 d。

1.5 血脂检测 5组大鼠在干预第56日后，均禁食不禁水12 h，经颈动脉用肝素钠试管采血4～5 mL。标本送至武汉市中西医结合医院检验科，采用Olympus AU2700型全自动生化分析仪，根据各指标试剂盒说明书，检测血浆中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量。

1.6 流式细胞仪检测大鼠腹腔巨噬细胞内MCP-1的分子表达水平 （1）提取大鼠腹腔巨噬细胞：参照兰青等［6］的方法提取SD大鼠腹腔巨噬细胞，具体步骤如下：颈椎脱臼处死大鼠，手提大鼠尾部将全鼠浸入70%酒精中，浸泡5 min后，再将其倒立提出，从大鼠腹腔一侧近腹股沟处注射1640培养液30～50 mL，将大鼠仰卧平放并用手指轻揉腹部3 min，静置5 min后，置大鼠于超净工作台上并打开大鼠腹腔，观察其肠管变扁且腹腔液为淡黄色时，用无菌滴管吸取其腹腔液约10 mL，1200 r/min离心8 min。去上清后，留下离心管底部乳白色沉淀物，继以1640培养液调整细胞至所需浓度。（2）固定及染色：将分离后的巨噬细胞液加至96孔U 型板，0.2×107/mL， 加入 PMA （5 ng/mL）、ionomycin（500ng/mL）和莫能霉素（Monensin）（终浓度为 2μmol/L）置37℃、5%CO2孵箱培养4 h后收集细胞，PBS洗1次，本实验中巨噬细胞表面抗原染色用的荧光标记的CD11 b抗体，可与巨噬细胞特异性结合，从而能够反映出大鼠腹腔巨噬细胞的含量。调整细胞浓度1×10/mL，50 μL细胞加入抗CD11 b抗体，4℃孵育30 min，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定4℃，30 min。PBS洗2次，第2次用含0.1%的皂苷，0.1%BSA的PBS洗细胞，调整细胞浓度 1×107/mL，50 μL 细胞加入 MCP-1 抗体，4℃孵育30 min，PBS洗 2次，PBS重悬细胞至0.3 mL，流式细胞仪检测。（3）设置流式检测对照：①空白孔2×105/0.3 mL细胞；②2×105/0.3 mL细胞加CD11 b抗体；③2×105/0.3 mL细胞加MCP-1抗体；④2×105/0.3 mL细胞加CD11 b抗体+MCP-1二标。

1.7 酶联免疫吸附法（ELASA）检测 检测大鼠腹腔巨噬细胞中IL-1γ的含量。从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，4℃，空白孔加标准品标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品（100 μL/孔），用封板胶纸封住反应孔，36 ℃孵箱孵育90 min，提前20 min准备生物素化抗体工作液，洗板5次，空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液（100 μL/孔），用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60 min，提前20 min准备酶结合物工作液，避光室温（22～25℃）放置，洗板5次，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液（100 μL/孔），用新封板胶纸封住反应。加入显色底物（TMB）100 μL/孔，避光 36℃孵箱，避光孵育 15 min，加入终止液50 μL/孔，混匀后即刻测量OD450值。将标准品浓度作横坐标，对应OD值做纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各组样本浓度值。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，继以LSD检验，计量资料以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血脂水平的比较 由表1可以看出，高脂饲料组大鼠血浆TC、LDL-C与正常对照组相比明显上升（P＜0.01），而 TG和 HDL-C无明显变化（P＞0.05）；高脂+普通饲料组大鼠血浆TC、LDL-C与高脂饲料组相比较明显降低（P＜0.01），较正常对照组仍明显升高（P＜0.01）；高脂饲料治疗组与高脂饲料组相比较，TC 和 LDL-C 明显降低（P＜0.01），高脂+普通饲料治疗组大鼠血浆中TC、LDL-C与高脂+普通饲料组相比较，明显降低（P＜0.01），而血浆TG和HDL-C无明显变化（P＞0.05）。

表1 各组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组大鼠血脂水平比较（mmol/L，±s）

组 别 n正常对照组 8高脂饲料组 8高脂+普通饲料组 8 TC TG HDL-C LDL-C 1.61±0.33 0.56±0.24 0.84±0.09 0.28±0.08 10.98±3.05** 0.68±0.21 0.62±0.21 5.48±1.06**6.77±1.08**△△ 0.61±0.18 0.65±0.19 2.80±0.64**△△高脂饲料治疗组 8 5.12±0.81**△△ 0.58±0.19 0.69±0.15 1.27±0.37*△△高脂+普通饲料治疗组 8 3.02±0.38△▲▲ 0.58±0.18 0.72±0.13 0.79±0.49△▲▲

与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与高脂饲料组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与高脂+普通饲料组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。 下同。

2.2 各组大鼠腹腔巨噬细胞含量及细胞内MCP-1的比较 由表2可以看出，高脂饲料组大鼠巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1表达率较正常对照组明显上升（P＜0.01），高脂+普通饲料组大鼠巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1表达率较高脂饲料组明显下降（P＜0.05），较正常组仍明显上升 （P＜0.05或 P＜0.01），高脂饲料治疗组与高脂饲料组相比较，巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1表达率明显下降 （P＜0.01），高脂+普通饲料治疗组与高脂+普通饲料组相比较，巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1表达率明显降低（P＜0.01），高脂+普通饲料治疗组与高脂饲料治疗组比较，巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1表达率明显降低（P＜0.01）。

表2 各组大鼠巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1 表达率比较（%，±s）

表2 各组大鼠巨噬细胞含量及巨噬细胞内MCP-1 表达率比较（%，±s）

组 别 n正常对照组 8高脂饲料组 8高脂+普通饲料组 8 CD11b MCP-1 16.29±1.73 2.88±0.42 65.14±3.74** 24.88±5.44**48.73±2.27**△ 13.77±0.87*△高脂饲料治疗组 8 36.91±2.54**△△▲▲ 8.43±0.55△△高脂+普通饲料治疗组 8 26.49±2.12*△△▲▲ 6.30±0.82*▲▲

2.3 各组大鼠腹腔巨噬细胞中IL-1γ的比较 见表3。结果示高脂饲料组大鼠巨噬细胞内IL-1γ浓度较其余4组显著上升（P＜0.01），高脂+普通饲料组大鼠巨噬细胞内IL-1γ浓度较正常对照组仍明显上升 （P＜0.05），高脂饲料治疗组较高脂+普通饲料组相比较，IL-1γ浓度显著降低（P＜0.01），高脂+普通饲料治疗组与高脂+普通饲料组及高脂饲料治疗组比较，IL-1γ浓度显著降低（P＜0.01）。

表3 各组大鼠巨噬细胞内IL-1γ浓度比较（nmol/mL，±s）

表3 各组大鼠巨噬细胞内IL-1γ浓度比较（nmol/mL，±s）

组 别 n正常对照组 8高脂饲料组 8高脂+普通饲料组 8 IL-1γ 26.27±1.20 47.10±1.52**40.82±0.84*△高脂饲料治疗组 8 35.01±0.64△▲▲高脂+普通饲料治疗组 8 30.42.30±0.49△▲

3 讨 论

高脂血症属于中医学“痰浊”、“瘀血”范畴，形成的外因多是由于嗜食肥甘、膏粱厚味，内因主要是脾肾运化输布不调，肝胆疏泄失畅。因此，高脂血症与高血压病、冠心病、脑血管病及肥胖症关系密切［7-8］。

丰隆穴始见于 《灵枢·根结》，是足阳明胃经的络穴，功能主要是化痰降浊、健脾通腑，可宣通脾胃两经的气机，脾为生痰之源，脾胃若运行正常则痰无所生。《玉龙歌》云“痰多宜向丰隆寻”，可见丰隆穴为化痰的首选穴。大量实验表明，中医的“痰”与自由基代谢异常有关，而丰隆穴的化痰作用除了能够调节血脂代谢，还能够改善机体的自由基代谢［9］。

高脂血症的形成主要是由于脂质代谢紊乱。高脂血症是AS形成最主要的危险因素，而炎症反应贯穿了AS形成过程的始终［10］。本实验结果表明，电针丰隆穴治疗高脂血症大鼠后，大鼠血浆TC、LDL-C明显降低，说明针刺丰隆穴下调血脂的作用是十分显著的。此外，高脂+普通饲料组大鼠血浆TC、LDL-C较高脂饲料组明显下降，说明了一定程度的控制高脂饮食对高脂血症的具有一些干预作用。

血脂代谢的异常与炎症反应、炎症细胞因子之间存在着密切的联系，单核细胞与内皮细胞的黏附是AS形成的第一个环节。单核细胞主要依赖其表面抗原CD11 b与内皮细胞进行黏附。有研究表明［11］，活化的单核细胞上的CD11 b的表达率显著上升，其在巨噬细胞的黏附、活化过程中发挥着重要作用，CD11 b表达量的改变能够反映巨噬细胞的活化状态。此外，有研究发现，机体MCP-1的含量与血浆胆固醇水平有关［12］。MCP-1属于趋化因子家族中的β家族，主要来源于内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞，巨噬细胞在MCP-1的趋化作用下进入炎症区；除此之外，MCP-1表达的升高能增强多种细胞因子和黏附分子的表达与合成，能上调单核细胞表面特异性黏附分子CD11 b的表达、激活白细胞黏附分子1的表达以及促进细胞因子IL-1、IL-6产生等作用，从而增强其黏附性而加重了组织损伤［13］；相反IL-1也能诱导MCP-1 mRNA和蛋白的表达，它们通过诱导内皮细胞产生MCP-1，趋化单核细胞进入动脉内膜，从而参与动脉粥样硬化的形成与发展［14］。

本实验提示，高脂饲料组大鼠腹腔巨噬细胞及其内MCP-1及IL-1γ的表达较正常对照组显著升高（P＜0.01），推测此时高脂血症大鼠处于炎症状态，其巨噬细胞表达增加，分化变强。高脂+普通饲料组大鼠腹腔巨噬细胞及其内MCP-1及IL-1γ的表达较高脂饲料组明显下降（P＜0.05），但其仍较正常组明显升高（P＜0.05），说明一定的饮食控制在治疗高脂血症方面有重要的干预作用，但单纯的饮食控制尚有局限［15］，所以仍需结合针灸治疗来下调血脂水平。高脂+普通饲料治疗组大鼠腹腔巨噬细胞、MCP-1及IL-1γ的表达较高脂饲料治疗组显著下降（P＜0.01），笔者推测电针丰隆穴能够能抑制大鼠腹腔巨噬细胞MCP-1表达，从而间接影响到IL-1γ的表达，而降低上述炎症因子的含量，从而减轻了炎症反应。然而这一过程涉及的机制十分复杂，尚需更深入的研究与探索。

［1］闻莉，刘松林，梅国强，等.高脂血症的中医临床证型分布及辨证规律研究［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14（3）：220-221.

［2］Gong WH，Zheng WX，Wang J，et al.Coexistence of hyperlipidemia and acute cerebral ischemia/reperfusion induces severe liver damage in a rat model［J］.World journal of gastroenterology： WJG，2012，18（35）：4934.

［3］张唐法，万文俊，张红星，等.电针丰隆穴治疗高脂血症的多中心观察［J］.中国临床康复，2006，10（9）：17-19.

［4］王琼，乐薇，覃鹏飞，等.三种高脂血症实验性大鼠模型的比较［J］.中国康复，2010，25（5）：330-331.

［5］邓春雷，殷克敬.实验针灸学［M］.北京：人民卫生出版社，1998：147-148.

［6］兰青，尹美珍，李世普.大鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定［J］.武汉理工大学学报，2009，31（9）：40-42.

［7］蒋玉萍，赵玉敏.高脂血症的病因及证治探析［J］.中医药学刊，2004，22（6）：1142.

［8］Juwiak S，Wójcicki J，Mokrzycki K，et al.Effect of quercetin on experimental hyperlipidemia and atherosclerosis in rabbits［J］.Pharmacological Reports，2005，57（5）：604-609.

［9］解秸萍，李蔚，农艳，等.丰隆穴对高脂血症大鼠不同脏器SOD，MDA 的影响［J］.中国针灸，2008，28（4）：293-296.

［10］Ross R.Atherosclerosis—an inflammatory disease［J］.New England Journal of Medicine，1999，340（2）：115-126.

［11］Oguchi S，Dimayuga P，Zhu J，et al.Monoclonal antibody against vascular cell adhesion molecule-1 inhibits neointimal formation after periadventitial carotid artery injury in genetically hypercholesterolemic mice［J］.Arteriosclerosis， Thrombosis，and Vascular Biology，2000，20（7）：1729-1736.

［12］Patterson KA，Zhang X，Wrobleski SK，et al.Rosuvastatin reduced deep vein thrombosis in ApoE gene deleted mice with hyperlipidemia through non-lipid lowering effects［J］.Thrombosis Research，2013，131（3）：268-276.

［13］SnellerMC，FauciAS.Pathogenesisofvasculitissyndromes［J］.Medical Clinics of North America，1997，81（1）：221-242.

［14］Rollins BJ，Yoshimura T，Leonard EJ，et al.Cytokine-activated human endothelial cells synthesize and secrete a monocyte chemoattractant，MCP-1/JE ［J］.The American Journal of Pathology，1990，136（6）：1229.

［15］苏蓉，于德水.高脂血症的危害及防治［J］.中国当代医药，2009，16（8）：128-129.

Effect of Electroacupuncture at Fenglong （ST40） Acupoint on the Expression of MCP-1 and IL-1γ in Macrophages of Hyperlipidemic Rats

TIAN Jiayu，CHEN Yingfang，WANG Qiong，et al.Wuhan University of Traditional Chinese Medicine，Hubei，Wuhan430022，China

Objective:To explore the effect of electroacupuncture at Fenglong （ST40） acupoint on inflammatory factors MCP-1 and IL-1γ of rats with hyperlipemia（HLP）.Methods:40 health SD rats were randomied into normal control group，high fat feed group，high fat+normal feed group，high fat feed treatment group，and high fat+normal feed treatment group，with 8 rats in each group.The high fat feed group was eatablished by feeding the animals with high fat forage for 28 days.After modeling，rats of high fat+normal feed group and high fat+normal feed treatment group were fed bassl forage.EA（2 mA，2 Hz/100 Hz） was applied to bilateral Fenglong（ST40）for 30 min，once daily for 28 days.After electro-acupuncture at Fenglong acupoint for 28 days，blood fat level，total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C），and high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C） were tested.Flow cytometry（FCM） and enzyme-linked immunosorbent assay（ELASA） were applied to observe changes of the expression of MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats.Results:The content of TC and LDL-C showed an apparent increase in high fat feed group as compared with normal control group and high fat+normal feed group （P＜0.01）.There were significant reductions in the content of TC and LDL-C after the treatment（P＜0.01）.The expression of MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats showed an apparent increase in high fat feed group as compared with normal control group （P＜0.01）and high fat+normal feed group （P＜0.05）and high fat+normal feed group still showed an apparent increase com-pared with normal control group （P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with high fat feed treatment group，the expression of macrophages，MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats decreased obviously in high fat+normal feed treatment group.Conclusion:Electro-acupuncture at Fenglong acupoint can not ably decrease the expression of macrophages as well as MCP-1 and IL-1γ in macrophages，thereby it has therapeutical effect on hyperlipemia.

Hyperlipemia；Electroacupuncture；Fenglong（ST40） Acupoint；Macrophages；MCP-1；IL-1γ

R245.9+7

A

1004-745X（2014）07-1212-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.002

国家自然科学基金资助项目（30873309）

△通信作者

2014-03-26）