宝藿苷Ⅰ纯度标准物质的研制*

孙欣光 ，黄文华 ，郭宝林 ，丁晓静 ，贺圆 ，刘军

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193；2.北京市疾病预防控制中心，北京 100013； 3.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，北京 100013）

宝藿苷Ⅰ （淫羊藿次苷II，BaohuosideⅠ）为小檗科淫羊藿属（Epimedium L）多种植物中的一种黄酮类化合物。药理研究表明宝藿苷Ⅰ 具有抗肿瘤、抗骨质疏松等作用［1–2］。《中国药典》（2010 年版）规定宝藿苷Ⅰ为淫羊藿饮片的质量控制成分。

笔者根据 JJF 1006–1994 等技术文件［3–4］研制了宝藿苷Ⅰ化学纯度有证标准物质，该标准物质可应用于相关化学药品、中药产品、保健品的质量控制，为实现我国准确定量检测药品与相关物质提供了标准物质资源，具有实际应用价值。

宝藿苷Ι分子结构如图1所示。

图1 宝藿苷Ι的分子结构

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱–质谱仪：Agilent 1100型，液相色谱仪（美国Agilent公司）和3200Qtrap型三重四极杆–离子阱复合型质谱仪（美国AB公司）；

核磁共振仪：AV–600型，德国Bruker公司；

高效液相色谱（HPLC）仪：2690型泵模块，996型DAD紫外检测器，Empower化学工作站，美国Waters公司；

毛细管电泳仪：P/ACE 5000型，具紫外检测器，配ACE Station工作站，美国贝克曼库尔特有限公司；

卡尔费林水分测定仪：DL39型，瑞士Merrler Toledo 公司；

热重分析仪（TGA）：Pyris 1 TGA型，美国PE公司；

乙腈：色谱纯，美国Fisher Scientific 公司；

卡尔费休试剂：HYDRANAL®–Coulomat AG –H 型，德国 Riedel–deHaen 公司；

超纯水：美国Milli-Q超纯水机制备。

1.2 标准物质的制备和纯化

研制的宝藿苷Ⅰ由淫羊藿提取物分离纯化获得，淫羊藿提取物购自陕西慧科植物开发有限公司。

将淫羊藿提取物通过正相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等分离纯化手段获得纯度流分，用HPLC法检测宝藿苷Ⅰ的纯度，合并纯度大于99.6%的流分，重结晶，常温干燥，对宝藿苷Ⅰ进行结构鉴定，用HPLC法对宝藿苷Ⅰ标准物质进行均匀性初验，分装到洁净的的棕色玻璃瓶中。共分装230瓶，每瓶约20 mg，常温、密封储存在干燥处。

1.3 定性分析

用液相色谱–质谱联用法和核磁共振技术对宝藿苷Ⅰ进行定性确认。

1.4 纯度定值分析

宝藿苷Ⅰ纯度标准物质采用HPLC法和胶束电动毛细管色谱（MECC）法进行定值。

1.4.1 样品溶液的制备

精密称取宝藿苷Ⅰ标准物质2 mg于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至标线，配制成200 μg/mL宝藿苷的甲醇溶液备用。

1.4.2 HPLC仪工作条件

色 谱 柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）–水（B），流速为1.0 mL/min；梯度淋洗程序：0～15 min，20%～28% B；15～20 min，28%～35% B ；20～40 min，35%～39% B ；40～60 min，39%～90% B ；60～62 min，30%～100% B ；柱温：30℃；检测波长：260，265，270，275 nm ；定值波长：270 nm；进样质量浓度：1 mg/mL。

1.4.3 MECC仪工作条件

毛细管：涂层熔融石英毛细管（47 cm×50 mm，河北鑫诺光纤色谱有限公司）；分离缓冲液：10 mmol/L Na2B4O7–10 mmol/L H3BO3–60 mmol/L十二烷基硫酸钠（SDS）混合溶液；样品介质：10 mmol/L Na2B4O7–10 mmol/L H3BO3–60 mmol/L SDS溶液；分离电压：13 kV；进样质量浓度：0.2 mg/mL；进样时间：3 s；进样压力：3 447.5 Pa；分离温度：25℃；检测波长：200 nm。

1.5 杂质分析

宝藿苷Ⅰ标准物质样品的杂质分析主要包括水分（含挥发性成分）和无机元素分析。

宝藿苷Ⅰ标准物质样品的水分用TGA法测定：取样品8 mg，初始温度35℃，稳定1 min后，以10℃/min升温至105℃（目的是使样品恒重），保持温度1 h，测定损失的质量。

采用ICP–MS法分析测定样品中73种无机元素的含量。若各部分杂质含量小于0.01%，则可忽略不计。

1.6 样品均匀性和稳定性考察

根据《一级标准物质技术规范》［3］的要求对宝藿苷Ⅰ标准物质样品进行均匀性检验。具体抽样检验方法：随机抽取15 瓶，进行瓶间均匀性检验；在任意一瓶取7 个子样，进行瓶内均匀性检验。检验方法为定值方法的HPLC 法，测量数据进行F检验和t检验。

标准物质的稳定性考察按先密后疏的原则，在一定时间间隔内选择定值方法即HPLC法，检测在规定条件下保存的标准物质纯度随时间的变化情况，通常情况下，分别在第 1，3，6，12个月进行稳定性监测。每次取5 瓶，每瓶取一个子样，测定3次，计算平均值，把5 瓶测量结果平均值作为检测结果。检测结果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

2.1.1 质谱分析

宝藿苷Ι标准物质样品的质谱图见图2。

图2 宝藿苷Ι的质谱图

由图2可见准分子离子峰［M+H］m/z514.92和［M+Na］m/z537.08，与宝藿苷Ι相对分子质量（513）相吻合。另外还可以得到脱去鼠李糖的离子碎片（m/z369.17）。

2.1.2 核磁共振谱分析

表1和表2分别为宝藿苷Ⅰ标准物质样品的1H–NMR和13C–NMR测定数据，表中数据与文献报道基本一致，表明此样品是宝藿苷Ι。

表1 宝藿苷Ⅰ标准物质样品的1H–NMR数据（DMSO）

2.2 纯度定值

从标准物质中随机抽取9 瓶，按1.4.1项下方法制备样品溶液，并分别按1.4.2项和1.4.3项的方法检测纯度，计算测定值的相对标准偏差，作为定值方法不确定度的一部分。两种定值方法的平均值作为定值结果。

2.2.1 HPLC法

制备的标准样品溶液采用HPLC法定值时，分别在波长为 260，265，270，275 nm 处进行检测，在波长270 nm处宝藿苷Ι有最大响应值，因此定值波长选为270 nm。图3 为宝藿苷Ⅰ纯度标准物质于270 nm下的HPLC定值谱图。

表2 宝藿苷Ι标准物质样品的13C–NMR数据（DMSO）

图3 宝藿苷Ⅰ纯度标准物质样品的HPLC谱图

从图3可以看出，宝藿苷Ⅰ与杂质实现了很好的分离，说明HPLC可以对其进行准确定值。

2.2.2 MECC法

制备的标准样品溶液采用MECC法定值时，为了使更多的杂质峰能够被检测到，选择200 nm作为检测波长。图4为宝藿苷Ⅰ纯度标准物质样品的MECC谱图，从图4可见，宝藿苷Ⅰ与杂质达到基线分离，可以对其纯度准确定量。

图4 宝藿苷Ⅰ纯度标准物质样品的MECC谱图

两种方法定值结果见表3。由表3可以看出HPLC法和MECC法两种定值结果的相对标准偏差分别为0.01%，0.08%，说明定值方法的重复性很好，符合标准物质制备的技术要求。

表3 宝藿苷Ι纯度标准物质纯度测定结果 %

2.3 杂质分析

宝藿苷Ⅰ纯度标准物质样品水分的测定结果为0.11%。

无机元素 Li，Be，B，Na，Mg，Al，Si，S，Cl，K，Ca，Sc，Ti，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu ，Zn，Ga，Ge，As，Se，Br，Kr，Rb，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Sb，Te，I，Cs，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Hf，Ta，W，Re，Os，Ir，Pt，Au，Hg，Tl，Pb，Bi，Th 和 U的含量之和小于0.01%，可忽略不计。

2.4 标准物质均匀性和稳定性考察

宝藿苷Ι标准物质均匀性检验和稳定性考察结果分别见表4、表5。

表4 宝藿苷Ι纯度标准物质均匀性检验结果 %

表5 宝藿苷Ι纯度标准物质稳定性检验结果

通过F检验法和t检验法对宝藿苷Ι纯度标准物质的均匀性进行考察，得F=3.73，查表知F0.05(14，6)=3.96，则F＜F0.05(14，6)，t=0，tα=0.003，t≤tα，表明瓶间和瓶内均匀性一致。在稳定性考察中发现定值结果没有出现显著的逐渐增大或减少的趁势，证明宝藿苷Ι纯度标准物质是稳定的。

2.5 定值不确定度评定

纯度标准物质定值结果的不确定度来源于标准物质的定值过程引入的不确定度、标准物质的不均匀性引入的不确定度和标准物质的不稳定性引入的不确定度。

2.5.1 HPLC法定值不确定度

（1）HPLC法定值测量重复性引入的不确定度u1，由测量的相对标准偏差计算，u1=0.01%。

（2）各组分不同检测波长的响应值引入的不确定度u2，综合考虑主成分和杂质化合物在相应检测波长处的响应，计算得u2=0.1%。

合成得HPLC法的测量不确定度：

2.5.2 MECC法定值不确定度

MECC法定值测量重复性引入的不确定度uCE，由测量的相对标准偏差计算，uCE=0.08%。

2.5.3 定值不确定度u

定值不确定度u由u与u不确定度合成：

2.5.4 定值结果的总合成不确定度

宝霍苷I标准物质样品的瓶间均匀性不确定度uH1、瓶内均匀性不确定度uH2、稳定性不确定度uT分别用其测定结果的相对标准偏差来表示，则合成不确定度uc由下式计算：

2.5.5 扩展不确定度

U＝kuc＝0.13%×2=0.26%≈0.3%。

2.6 定值结果

宝藿苷Ι标准物质样品的标准值采用质量平衡法，即采用HPLC 和MECC 两种定值技术测量值的平均值扣除水分等无机杂质之后的结果。

宝藿苷Ι标准物质样品的标准值：

P=(1–0.11%)×[(99.85%+99.72%)/2]=99.7%

定值结果为(99.7±0.3)%，k=2。

3 结语

宝霍苷I纯度标准物质原料经过质谱、核磁定性分析后，分别进行了水分、无机元素含量分析。采用两种不同原理的方法对宝霍苷I标准物质进行定值，避免了由单一方法定值测量的系统误差。对宝霍苷I标准物质进行杂质分析、均匀性检验、稳定性考察、不确定度评定，所使用的量值及不确定度都是准确可靠的。化学纯度标准物质研制将对我国药品的质量有效控制起到积极的促进作用［5–8］。

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