氨基丁酸联合卡泊芬净的体外抗白色假丝酵母菌协同作用研究

刘懿萱，蒋京辰，叶春林(武警上海市总队医院，上海 201103)

白色假丝酵母菌(Candidaalbicans)又称白色念珠菌，是临床最常见的条件致病性真菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道等。随着癌症治疗、器官移植、广谱抗生素、免疫抑制剂和细胞毒性药物的广泛使用，深部真菌感染已经发展成为免疫功能低下患者死亡的主要原因[1]。在深部真菌感染中，白色假丝酵母菌是最常见的病原菌，目前临床用于治疗白色假丝酵母菌感染的药物主要为氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净等。其中卡泊芬净属于棘白菌素类抗真菌药物[2]，是一种β-( 1， 3)-葡聚糖合成酶的非竞争性抑制剂，目前临床主要用于系统性治疗侵袭性曲霉病和念珠菌病。然而临床上真菌耐药现象日益严重，已成为临床抗真菌治疗失败的主要原因[3]。因此，联合用药发挥协同作用、缩短疗程、减少药物毒副作用、扩大药物抗菌谱、降低耐药性，是目前深部真菌感染治疗研究领域的一个重要研究方向[4]。氨基丁酸 (aminobutyric acid， GABA) 广泛存在于自然界，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，其具有较广泛的生物学功能，如降血压作用、镇痛作用等[5]，暂未发现其抗真菌作用。GABA是机体本身所具有的活性物质，作为一种新型的功能因子，愈来愈受到人们的关注，正成为医药、食品、农业等领域的一个热点研究内容[6]。此外，本院前期研究发现，包括氨基丁酸在内的多种氨基酸联合卡泊芬净表现出协同关系(数据未发表)，故本实验选取氨基丁酸作为主要研究对象。

本研究首次探讨氨基丁酸的抗真菌活性，并将氨基丁酸与临床上一种很有前途的系统性抗真菌药物卡泊芬净联合应用抗白色假丝酵母菌标准菌株SC5314，为临床抗真菌感染提供新的治疗方案。

1 仪器与材料

1.1仪器 THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；SW-CT-IF型单人双面超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Hitech-KFLow 超纯水机(上海华耀贸易有限公司)；96孔细胞培养板(丹麦Nunclon公司产品)；Multiskan MK3型酶标检测仪(芬兰Labsystems公司)。

1.2受试菌株 白色假丝酵母菌国际标准株SC5314由美国华盛顿乔治敦大学免疫微生物教研室William A.Fonzi教授惠赠，于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化[7]，30 ℃培养24～48 h后，于4 ℃保存备用。

1.3培养基 YNB培养液：YNB无氨基酵母氮源(Sigma公司) 6.7 g，葡萄糖 20 g，加去离子水定容至1 000 mL，0.45 μm微孔滤膜 过滤除菌，分装后于4 ℃保存备用；沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加去离子水900 mL溶解，加入2 μg·mL-1氯霉素水溶液50 mL，调整pH至7.0，定容至1 000 mL，高压灭菌(121 ℃， 15 min)后于4 ℃保存备用；YEPD培养液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖 20 g，加去离子水900 mL溶解，定容至1 000 mL，高压灭菌(121 ℃，15 min)后于4 ℃保存备用。

1.4试药 氨基丁酸(GABA)和卡泊芬净(CAS)均订购于Sigma公司。氨基丁酸用DMSO(Sigma公司)溶解为0.2 mmol·L-1的药物母液，-20℃储存备用。卡泊芬净用DMSO溶解为2 μg·mL-1药物母液，-20℃储存备用。

2 方法

2.1药物敏感性实验 采用1997年临床实验室标准化委员会(CLSI)公布的《酵母菌的液基稀释法抗真菌药物敏感实验参考方案》[M2-A][8]。

2.1.1菌悬液制备 实验前，用接种环从4 ℃保存的SDA培养基上挑取白色假丝酵母菌单克隆，接种至1 mL YEPD培养液中，于30 ℃以200 r·min-1振荡培养，使其活化16 h，离心弃上清，稀释相应倍数后在显微镜下用血细胞计数板计数，以YNB培养液调整菌液浓度至1×103～5×103cells·mL-1。

2.1.2药敏反应板的制备和棋盘式微量稀释法 取无菌96孔板，于每排1号孔加YNB液体培养基100 μL作空白对照；3～12号孔分别加入新鲜配制的菌液100 μL；2号孔分别加98 μL菌液和2 μL的药物溶液；2～11号孔逐级倍比稀释，12号孔不加药物，只加入100 μL菌液作为阳性对照。合用的2种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2至11)2个方向分别进行2倍的倍比稀释。氨基丁酸与卡泊芬净合用后，使得卡泊芬净的终质量浓度为1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625，0.007 812 5，0.003 906 25和0.001 953 125 μg·mL-1，氨基丁酸的终浓度为20，10，5，2.5，1.25和0.625 μmol·L-1。

2.1.3最低抑菌浓度(MIC值)和联合用药效果评价 在30 ℃培养48 h后，启用酶标仪于发射波长630 nm，测定96个孔中白色假丝酵母菌的A值。与阳性对照孔相比，以A值下降80%以上的最低浓度孔中的药物质量浓度为MIC80(真菌生长80%被抑制时的最低药物浓度)。部分抑菌浓度指数 (fractional inhibitory concentration index， FICI)是评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数。抑菌浓度分数(FIC)分别为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度(MIC)与单用时MIC的比值，而FIC指数(FICI)则等于2种药物FIC之和。当FICI≤0.5时，两药的相互作用确定为协同作用；0.54时两药产生拮抗作用[9]。

2.2抗真菌敏感性实验 取该菌液至1 mL YNB培养液中，用上述方法再次活化16 h，离心弃上清，以YNB培养液调整菌液浓度至105个·mL-1。各试管药物终质量浓度为：卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸0.312 5 μmol·L-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸0.625 μmol·L-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸1.25 μmol·L-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸2.5 μmol·L-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸5 μmol·L-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸10 μmol·L-1，卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸20 μmol·L-1，空白组不加药物处理。在30 ℃培养箱中以200 r·min-1的转速培养16～24 h后，观察各组试管浑浊情况。

2.3YNB培养液中生长曲线 取该菌液至YNB培养液中，以紫外分光光度计630 nm处测菌液A值，以YNB培养液稀释并调整菌液浓度至A值为0.1。分别于100 mL上述菌液中加入氨基丁酸1.25 μmol·L-1、卡泊芬净 0.012 5 μg·mL-1和氨基丁酸1.25 μmol·L-1+卡泊芬净0.012 5 μg·mL-1，对照组加入相同体积的DMSO以消除差异，所有菌液中所含DMSO的量不高于0.5%。在30 ℃培养箱中以200 r·min-1的转速培养，分别在0，4，6，8，10，12和24 h从各个样品中取出100 μL菌液，在紫外分光光度计630 nm波长处测量菌液的A值，来分析生长浓度的变化趋势。

2.4统计学处理 所有实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验，实验数据采用SPSS 16.0分析软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，数据以*P<0.05表示。

3 实验结果

3.1棋盘式微量稀释法实验结果 实验结果显示，单用氨基丁酸对SC5314的MIC80测定值>20 μmol·L-1，与卡泊芬净联合使用后，MIC80测定值降低了16倍，下降至1.25 μmol·L-1；并且联合使用后卡泊芬净的MIC80测定值由1.56×10-2μg·mL-1降至3.91×10-3μg·mL-1。依据以上数据，可以得出单用氨基丁酸的FIC值为0.065；单用卡泊芬净的FIC值为0.25。所以两药合用的FIC指数(FICI)为0.3125(FICI<0.5)，说明氨基丁酸联合卡泊芬净表现出协同关系。

3.2抗真菌敏感性实验结果 结果如图1所示。在YNB培养基中培养16 h后，0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净单用组与空白组的浑浊程度没有明显差异；而0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净与0.312 5～0.625 μmol·L-1氨基丁酸合用后与空白组的浑浊程度没有明显差异；但0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净与1.25～20 μmol·L-1氨基丁酸合用后与空白组相比，可以直观地观察到试管内浑浊程度明显减弱。表明0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净联合氨基丁酸体外对白色假丝酵母菌SC5314的抑制作用以1.25 μmol·L-1为界限，氨基丁酸浓度≥1.25 μmol·L-1时能抑制SC5314的生长。

图1 氨基丁酸联合卡泊芬净抗白色假丝酵母菌敏感性实验

3.3生长曲线实验结果 结果见图2。结果显示，不加药物的空白组与1.25 μmol·L-1氨基丁酸作用组和0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净作用组的生长曲线没有显著差异；但在1.25 μmol·L-1氨基丁酸和 0.012 5μg·mL-1卡泊芬净合用后的生长情况差别很大：1.25 μmol·L-1氨基丁酸和 0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净合用8 h内对白色假丝酵母菌标准菌株SC5314的生长曲线的抑制作用与其他3组没有差别，10 h后生长抑制作用显著强于其他3组。

图2 氨基丁酸联合卡泊芬净抗白色假丝酵母菌生长曲线

4 讨论

真菌的耐药现象日趋严重，是临床治疗深部真菌感染失败的重要原因[10]。联合用药是目前抗真菌药的研究热点之一，不仅能够缩短治疗周期、降低药物毒副作用和剂量，而且还可扩大药物抗菌谱、降低耐药性。

卡泊芬净具有广泛的体外抗真菌活性， 尤其对曲霉和白色假丝酵母菌有很强的作用[11]。氨基丁酸(aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，虽然暂时未发现其抗真菌作用，但其具有不良反应小、来源广、价格低廉等优势，是研究开发其作为抗真菌药物尤其是联合抗真菌药物，具有良好的前景。氨基丁酸单用时MIC80测定值>20 μmol·L-1，与卡泊芬净联合使用后，MIC80测定值降低了16倍，下降至1.25 μmol·L-1；单用氨基丁酸的FIC值为0.065；单用卡泊芬净的FIC值为0.25。所以两药合用的FIC指数(FICI)为0.312 5(FICI<0.5)，说明氨基丁酸联合卡泊芬净表现出协同关系。在抗真菌敏感性实验中，0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净与空白组对比没有显著差异，但0.012 5 μg·mL-1的卡泊芬净合用1.25 μmol·L-1氨基丁酸可以直观地观察到试管内浑浊程度减弱，表明0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净联合氨基丁酸体外对白色假丝酵母菌SC5314的抑制作用以1.25 μmol·L-1为界限，氨基丁酸浓度≥1.25 μmol·L-1时能抑制SC5314的生长。此外，在生长曲线实验中，0.012 5 μg·mL-1卡泊芬净合用1.25 μmol·L-1氨基丁酸后的生长曲线显著(10，12和24 h 3个点的A值，3组之间进行P检验，P<0.05)低于同浓度下两药单用的生长曲线。由以上实验结果可以看出，氨基丁酸本身没有抗真菌活性，但与卡泊芬净合用后有显著的协同关系，抗真菌作用显著增强。

本实验首次发现氨基丁酸与卡泊芬净合用后有显著的协同关系，可为临床用药提供新的治疗方案，可通过联合用药的方案来提高抗真菌药物的治疗效果，降低药物的毒性。有关氨基丁酸协同卡泊芬净抑制真菌的作用机制有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 廖万清，顾菊林. 深部真菌感染治疗的现状与对策[J]. 中国感染与化疗杂志， 2007， 7(2): 101-103.

[2] 陈辉，刘维达. 新型抗真菌药物卡泊芬净及其在临床的应用[J]. 国外医学皮肤性病分册，2005，31(1): 9-11.

[3] 路晓钦， 黎莉华， 周丽，等. 白色假丝酵母菌感染分布及耐药性分析[J]. 中国感染控制杂志，2007，6(6): 419-421.

[4] Nivoix Y， Zamfir A， Lutun P，et al. Combination of caspofungin and an azole or an amphotericin B formulation in invasive fungal infections[J]. J Infect， 2006，52(1): 67-74.

[5] 王燕，王贤勇.γ-氨基丁酸的生物学功能研究及其应用前景[J]. 新饲料，2008(3): 44-46.

[6] 宋伟，马霞，张柏林.γ-氨基丁酸的生理功效及其在乳品中的强化途径[J]. 乳业科学与技术，2008(6): 297-302.

[7] 李秋菲， 高飞， 李霞利，等. 阴道用制剂控制白色假丝酵母菌检验方法的研究[J]. 西北药学杂志，2012，27(6): 468-470.

[8] National Committee for Clinical and Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts: approved standard M27-A[M]. NCCLS， Wayne， Pa. 1997，17(9): 1-21.

[9] Odds F C. Synergy， antagonism， and what the chequerboard puts between them[J]. J Antimicrob Chemother， 2003，52(1): 1-9.

[10]Morschhauser J. Thegenetic basis of fluconazole resistance development inCandidaalbicans[J]. Biochin Biophys Acta， 2002，1587: 240-248.

[11]Colombo A L， Perfect J， Di Nubile M， et al. Globaldistribution and outcomes forCandidaspecies causing invasive candidiasis: results from an international randomized double-blind study of caspofungin versus amphotericin B for the treatment of invasive candidiasis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2003，22: 470-474.