南方水牛奶酪蛋白及大豆蛋白肽指纹图谱的差异性*

徐明芳 戴金凤 向明霞 成希飞 曾晓琮 万丛庆 周卫军

(暨南大学 生命科学技术学院，广东 广州 510632)

近年来，虽然各种质谱技术在硬件和软件方面都得到不断完善，但分析和鉴定复杂体系中的组分还是一大挑战，对混合蛋白质的鉴定和分析也还是蛋白质组学的重要任务［1］.二维线性离子阱高分辨静电场组合质谱LTQ Orbitrap XL 组合型傅里叶变换质谱是整合了LTQ 线性离子阱质谱仪和Orbitrap轨道阱质量分析器的组合式质谱仪系统.在LTQ 灵敏、快速的基础上增加了轨道阱技术，具有高分辨率、高质量准确度的特点，只需要纳克级的蛋白质样品量，就可用于各种蛋白质及多肽鉴定、蛋白质肽指纹图谱及未知蛋白质多肽部分测序、蛋白质磷酸化位点分析、蛋白质活性多肽位点突变分析、二硫键分析等研究，具备了从复杂体系中快速、灵敏、可靠地检测化合物的能力和持久稳定的质量精密度、卓越的LC/MSn性能、超强的小分子分析能力等特性，其优异的性能使其在常规化合物的鉴定、复杂体系中痕量物质的分析等领域都有广泛的应用，也广泛应用在蛋白质组学研究中.

水牛奶因酪蛋白含量丰富，且能进行高质量乳制品的深加工，具有无可限量的开发潜力.为了防止在水牛奶中人为添加廉价蛋白代替牛奶蛋白，导致牛奶蛋白营养价值下降，目前已有多种技术运用于牛奶乳蛋白的分析，如毛细管电泳［2］、双向电泳［3］、反向高效液相色谱［4］、质谱［5］及液质联用［6］等，这些方法对乳蛋白的定量(反向高效液相色谱、毛细管电泳)、乳蛋白亚基组分分离及鉴定［7］(双向电泳、液质联用)等都有报道，但对于乳蛋白肽质量指纹图谱及氨基酸精细结构的分析，双向电泳与质谱连用技术则呈现出耗时、双向电泳胶条及试剂依赖进口产品、分析成本高等不足.近年来随着生物质谱分析技术水平的不断提高，LTQ Orbitrap MS 对于完整的蛋白质分子质量的测定和酶解肽段的结构特征分析［8］具有高效、快速、分析成本低等显著的优越性，已广泛应用于蛋白质及其他化学物质的分析［9-12］.

文中应用LTQ Orbitrap XL 组合型傅里叶变换高分辨质谱联合反相高效液相色谱技术建立了水牛奶酪蛋白各组分和大豆分离蛋白(SPI)主要组分的肽质量指纹图谱，并对其完整的氨基酸序列差异性进行了分析，以期为准确、高效鉴定牛奶中是否添加廉价蛋白提供可靠的方法，为复杂体系中鉴定分析微量物质提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水牛奶，购于当地零售商;大豆分离蛋白［13］，华南理工大学植物蛋白深加工实验室提供;乙腈、碳酸氢铵、三氟乙酸(TFA)、DL-二硫苏糖醇(DTT)、吲哚-3-乙酸(IAA)，美国Sigma 公司产品;胰蛋白酶，美国Promega 公司产品;LTQ Orbitrap XL 质谱仪，Thermo 公司生产;C18 反相色谱柱，Michrom Bioresources 公司生产;SCIENTZ-11D 型超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物仪器公司生产.

1.2 溶液配制

用双重去离子水配制以下实验用溶液:100mmol/L NH4HCO3(790.6 mg NH4HCO3溶于去离子水中，定容到100 mL);脱色液(2.5 mL 100%乙腈，1.25 mL 100 mmol/L NH4HCO3，1.25 mL ddH2O);还原剂(12.4 mg DTT，2 mL 100 mmol/L NH4HCO3，6 mL ddH2O);烷基化试剂(40.69mg IAA，1mL 100mmol/L NH4HCO3，3 mL ddH2O);覆盖液(1 mL100 mmol/L NH4HCO3，0.4 mL 100%乙腈，2.6 mL ddH2O);酶液储液(2 μg 胰蛋白酶加入到150 μL 预冷的覆盖液中)，-80 ℃下保存;胰蛋白酶工作液，用覆盖液将酶液储液稀释至胰蛋白酶含量为0.02 g/L;萃取液(0.075 mL TFA，2.01 mL 100% 乙腈，0.915 mL ddH2O);蛋白样品溶解液(0.001 mL 甲酸，0.02 mL 100%乙腈，0.979 mL ddH2O;25 mmol/L NH4HCO3(含10 mmol/L DTT )混合溶液(19.77 mg NH4HCO3，15.43 mg DTT，10 mL ddH2O).

1.3 实验方法

1.3.1 SDS-PAGE 凝胶电泳

取60 mL 新鲜水牛奶，4 ℃条件下4000 r/min 离心20 min，脱脂，调pH 值至4.6，4 000 r/min 离心15 min，取沉淀用蒸馏水、丙酮依次洗涤两次，每次4000 r/min离心10 min.收集沉淀风干.将沉淀酪蛋白与大豆分离蛋白用样品溶解液分别配制成2 g/L的蛋白样品溶液，备用.SDS-PAGE 电泳，两种蛋白样品上样量均为10 μL，浓缩胶4%，浓缩电压60 V;分离胶12%，分离电压100 V.

1.3.2 酶解

刀片切下胶点，用去离子水洗胶两次，每次振荡1 min，静置5～10 min 后去掉液体，加入50%乙腈溶液，37 ℃水浴脱色至透明为止，再用100%乙腈脱水至胶块变成白色，加入还原剂，用25 mmol/L 的NH4HCO3(含10 mmol/L DTT)封口，57 ℃水浴1 h，然后室温冷却，去掉液体，迅速加入同体积的烷基化试剂，室温暗处放置30min 后去掉烷基化试剂，加入50%乙腈溶液，放置15 min 后，加入50 mmol/L 的NH4HCO3震荡后静置吸胀5 min，再加50%乙腈脱水一遍，100%乙腈脱水至胶块变成白色，加入约2～3 μL 酶液(采用常规胰蛋白酶进行酶解，酶液质量浓度为0.01 g/L )冰上放置30 min，直至胶块吸胀酶液，加覆盖液20 μL 封口，37 ℃保温16～18 h.取出样品，在10 000 g/min 条件下超速离心5 min，取上清液加入到EP 管中，剩余胶块加入萃取液中37 ℃保温30 min，超声，取上清液加入之前的EP 管中，冻干.

1.3.3 质谱分析

冻干的酶解片段用样品溶解液溶解，充分振荡涡旋，13200 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液进行质谱分析.样品经C18 反相柱(100 mm ×100 μm i.d，3 μm)分离后，用于LTQ Orbitrap XL 检测.样品在反相柱上洗脱梯度5%～45%乙腈(含0.1%甲酸)，洗脱60 min，流速300 nL/min.

质谱参数:离子传输管温度200 ℃;电喷雾电压为1.85 kV.一级质谱Orbitrap 扫描范围是400～2000 u，从一级质谱里选取信号较强的母离子做二级质谱，动态排除功能开启，时间90 s.二级质谱LTQ 为CID 碰撞模式，标准化碰撞能量为35%，活化q 值0.25，活化时间30 ms.肽段信息通过Mascot搜寻软件上网(http:∥www.matrixscience.com)进行蛋白质库搜寻鉴定得出结果.

2 结果与分析

经过胰蛋白酶水解的水牛奶酪蛋白和大豆蛋白的多肽混合物经LTQ Orbitrap XL 组合型傅里叶变换高分辨质谱分析，根据Mascot 得分、匹配的肽段片段数和覆盖率等综合评判，可以分别鉴定出水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分的信息.以αs酪蛋白(αs-CN)为例，水牛奶αs-CN 的总离子流指纹图谱(一级质谱图)如图1 所示.选出的母离子经过二级质谱鉴定肽段的氨基酸序列，其二级质谱图及其匹配的氨基酸序列如图2 所示，根据这些肽段信息检索数据库，可以鉴定图2 所有的肽段均属于αs1酪蛋白.

图1 水牛奶αs-CN 酪蛋白的总离子流指纹图谱Fig.1 Total ionic chromatographic fingerprints of αs-CN of water buffalo milk casein

图2 水牛奶αs-CN 肽段组分二级质谱图Fig.2 MS/MS spectra of αs-CN peptide fragmentation of water buffalo milk casein

2.1 水牛奶酪蛋白氨基酸序列信息

水牛奶酪蛋白由一类结构和性质较近似的蛋白组成，主要包括αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，其含量分别占全酪蛋白的48%、34%、12%左右，其中αs-酪蛋白又分为αs1-CN 和αs2-CN，αs1-CN、αs2-CN分别占αs-CN 的38%和10%左右.南方水牛奶酪蛋白经胰蛋白酶酶解得到的片段经LTQ Orbitrap XL MS 分析，可鉴定出全部的肽段.得到的肽段经分析可鉴定出肽段的来源，如HQGLPQGVLNENLLR、HKEMPFPK、IAKYIPIQYVLSR 分别属于αs1-CN、β-CN和κ-CN 的酶解肽段.水牛奶酪蛋白αs1-CN、β-CN和κ-CN 经酶解得到的全部肽段信息通过Mascot 软件搜索可以获得水牛乳酪蛋白氨基酸组成的全序列(见表1)，但结果中没有搜索到与水牛奶αs2-CN 相匹配的氨基酸肽段序列.

2.2 大豆蛋白氨基酸序列信息

大豆中含有30%～50%的大豆蛋白，经过提纯得到大豆分离蛋白，大豆分离蛋白是一种价格低廉的全价蛋白，蛋白质含量不少于90%，主要由功能和营养特性各异的球蛋白2S、7S、11S 和15S 组成，其中7S 和11S 占大豆球蛋白的70%以上，7S 组分主要为大豆伴球蛋白(Conglycinin)，11S 组分则为大豆球蛋白(Glycinin).从聚集态结构分析，7S 含有3 种不同的亚基，为三聚体;而11S 含有5 种不同的亚基，为六聚体［14-17］.经过质谱鉴定分析，分别获得11S 的5 个亚基和7S 的3 个亚基蛋白的氨基酸肽段序列及不同亚基的氨基酸全序列，如表2、表3所示.

水牛奶酪蛋白和大豆蛋白在蛋白组分、分子质量及亚基组分的氨基酸序列等方面均呈现出明显的差异，如表4 所示.

表4 结果显示，大豆蛋白经胰蛋白酶酶解得到的肽段数量(181 个)远超出酪蛋白经胰蛋白酶酶解得到的肽段数量(28 个)，最多的为β 伴大豆球蛋白α 链亚基，经酶解可检测出30 个肽段，而αs酪蛋白最多检出12 个肽段，尤其重要的是，在大豆蛋白酶解得到的所有肽段中不能找到与酪蛋白经酶解得到的肽段相匹配的肽段.此外，大豆蛋白的各组分亚基的氨基酸全序列均大于酪蛋白各组分的氨基酸全序列，且大豆蛋白各组分的分子质量均显著高于酪蛋白各组分，氨基酸序列最长的为β 伴大豆球蛋白α链，氨基酸数量为617，分子质量为74565 u.

表1 水牛奶酪蛋白全氨基酸序列1)Table 1 Amino acid sequences of water buffalo milk casein

表2 大豆球蛋白氨基酸序列Table 2 Amino acid sequences of soybean glycinin

续表

表3 大豆β 伴球蛋白氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of soybean β-conglycinin

表4 水牛奶酪蛋白和大豆蛋白差异性Table 4 Differences of water buffalo milk casein and soybean protein

2.3 水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分氨基酸的对比

不同蛋白的营养价值不同，蛋白质的营养价值常用生物价(BV)来衡量，生物价越高说明蛋白被有机体的利用率越高，营养价值也就越高，而蛋白的营养价值与氨基酸的数量、排列方式和组成比例都有关系，牛奶的生物价约为85，大豆的生物价约为64.根据质谱鉴定获得的结果，对水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要组分氨基酸全序列进行比较，结果显示，酪蛋白和大豆蛋白都含有丰富的氨基酸，但氨基酸数量、组成比例和排列方式都有明显的差异.就其数量而言，酪蛋白的前体信号肽氨基酸的数量及酪蛋白主链的氨基酸数量与大豆蛋白都不相同，且大豆蛋白的氨基酸主链的氨基酸数量均多于水牛奶酪蛋白的氨基酸数量.就氨基酸组成比例而言，20 种氨基酸中，除苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸外，各种必需氨基酸占其全序列比例最大的都属于酪蛋白，除丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和脯氨酸外，各种非必须氨基酸占其全序列比例最大的都属于大豆蛋白，其中，酪蛋白中各组分脯氨酸所占氨基酸序列的比例均大于大豆蛋白，精氨酸和天冬酰胺所占氨基酸序列的比例均小于大豆蛋白.在8 种必需氨基酸中，苏氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸所占比例最高的均属于酪蛋白分子;苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸所占比例最高的属于大豆蛋白.在12 种非必需氨基酸中，丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸比例最高的属于酪蛋白分子，其他8 种氨基酸比例最高的属于大豆蛋白，如表5 所示，这从乳源蛋白肽质指纹结构中证实了乳源蛋白的生物效价高于植物大豆蛋白.就氨基酸排列而言，酪蛋白和大豆蛋白氨基酸的排列方式差异很明显，而大豆蛋白的同种蛋白亚基间虽氨基酸的数量有差异，但排列方式却有许多相同的地方.酪蛋白中蛋白分子αs1-CN，β-CN 不含半胱氨酸，大豆β 伴球蛋白的β 链不含甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸，这为今后蛋白组分的差异鉴定提供了依据.

表5 酪蛋白和大豆蛋白主要蛋白组分氨基酸比例Table 5 Proportion of amino acids of main protein of water buffalo milk casein and soybean protein %

续表

3 结语

通过LTQ Orbitrap XL 对酪蛋白和大豆蛋白的各个组分进行分析，获得水牛奶酪蛋白主要组分(αs1-CN、β-CN、κ-CN)和大豆蛋白主要组分(包括大豆球蛋白G1、G2、G3、G4、G5 和大豆伴球蛋白α、α'、β 链)共11 种蛋白组分的肽段的氨基酸序列信息，及各组分的完整氨基酸序列.通过比较发现，水牛奶酪蛋白氨基酸序列经胰蛋白酶酶解获得的肽段数量及蛋白各组分氨基酸全序列，在氨基酸数量、排列方式和组成比例等方面都与大豆蛋白有明显的差异.此方法为今后快速准确地鉴定水牛奶中廉价的大豆蛋白以及从复杂体系中检测微量物质提供了可靠的依据.

［1］Erve John C L，Gu M，Wang Y D，et al.Spectral accuracy of molecular ions in an LTQ/Orbitrap mass spectrometer and implications for elemental composition determination［J］.Am Soc Mass Spectrom，2009，20:2058-2069.

［2］王丽娜，李子超，李昀锴，等.基于毛细管区带电泳系统的南方水牛奶酪蛋白分析技术研究［J］.分析测试学报，2011，30(3):264-268.Wang Li-na，Li Zi-chao，Li Yun-kai，et al.Analysis of waterbuffalo caseins in South China by capillary zone electrophoresis［J］.Journal of Instrumental Analysis，2011，30(3):264-268.

［3］Kuhla S，Rudolph P E，Albrecht D，et al.A milk diet partly containing soy protein does not change growth but regulates jejunal proteins in young goats［J］.Journal of Dairy Science，2007，90:4334-4345.

［4］Bonfatti Valentina，Grigoletto Luca，Cecchinato Alessio，et al.Validation of a new reversed-phase high-performance liquid chromatography method for separation and quantification of bovine milk protein genetic variants ［J］.Journal of Chromatography A，2008，1195:101-106.

［5］Aline Soriano L，Jerusa Simone G，Rodrigo Ramos C，et al.Cloud point extraction applied to casein proteins of cow milk and their identification by mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2007，590:166-172.

［6］Czerwenka Christoph，Muller Lukáš，Lindner Wolfgang.Detection of the adulteration of water buffalo milk and mozzarella with cow's milk by liquid chromatography-mass spectrometry analysis β-lactoglobulin variants［J］.Food Chemistry，2010，122:901-908.

［7］向明霞，王丽娜，徐明芳.基于双向电泳和质谱联用技术的水牛乳源酪蛋白的研究［J］.食品工业科技，2012，33(12):188-190，200.Xiang Ming-xia，Wang Li-na，Xu Ming-fang.Analysis of water buffalo milk in South China by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry combined technology［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33(12):188-190，200.

［8］Ansari Parisa，Stoppacher Norbert，Rudolf Judith，et al.Selection of possible marker peptides for the detect ion of major ruminant milk proteins in food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2010，399(3):1105-1115.

［9］Dunn W B，Broadhurst D，Brown M，et al.Metabolic profiling of serum using ultra performance liquid chromatography and the LTQ-Orbitrap mass spectrometry system［J］.Journal of Chromatography B，2008，871:288-298.

［10］Peng J B，Jia H M，Liu Y T，et al.Qualitative and quantitative characterization of chemical constituents in Xin-Ke-Shu preparations by liquid chromatography coupled with a LTQ Orbitrap mass spectrometer［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，55:984-995.

［11］徐明芳，戴金凤，向明霞，等.基于LTQ-Orbitrap 液相色谱-质谱联用技术的乳源乳清蛋白组分的差异性研究［J］.分析化学，2014，42(4):501-506.Xu Ming-fang，Dai Jin-feng，Xiang Ming-xia，et al.Study on differences of milk proteins by Linear Trap Quadropole-Orbitrap LC-MS/MS［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2014，42(4):501-506.

［12］Théberge R，Infusini G，Tong W W，et al.Top-down analysis of small plasma proteins using an LTQ-Orbitrap.Potential for mass spectrometry-based clinical assays for transthyretin and hemoglobin ［J］.International Journal of Mass Spectrometry，2011，300:130-142.

［13］杨国龙，赵谋明，杨晓泉，等，选择性酶解-超滤制备大豆改性蛋白［J］.华南理工大学学报:自然科学版，2005，33(10):78-83.Yang Guo-long，Zhao Mou-ming，Yang Xiao-quan，et al.Preparation of modified soy protein by selective Enzymolysis-Ultrafiltration［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2005，33(10):78-83.

［14］赵谋明，张远红，崔春，等，胃蛋白酶前处理对大豆蛋白酶解特性的影响［J］.华南理工大学学报:自然科学版，2012，40(8):110-115.Zhao Mou-ming，Zhang Yuan-hong，Cui Chun，et al.Effect of pepsin pretreatment on hydrolysis characteristics of soy protein ［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2012，40(8):110-115.

［15］朱晓烨，迟玉杰，刘红玉.大豆蛋白7S 和11S 组分分离方法的优化［J］.食品工业科技，2011，32(7):267-273.Zhu Xiao-ye，Chi Yu-jie，Liu Hong-yu.Optimization of separation method of 7S and 11S in soy protein［J］.Science and Technology of Industry，2011，32(7):267-273.

［16］于泓鹏，唐传核，曾庆孝，等.大豆分离蛋白水解多肽聚集物的组成及相互作用［J］.华南理工大学学报:自然科学版，2006，34(8):105-109.Yu Hong-peng，Tang Chuan-he，Zeng Qing-xiao，et al.Composition and interaction of aggregate of peptides derived from soy protein lsolates［J］.Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2006，34(8):105-109

［17］管娟，田琨，姚晋荣，等.高分子量大豆蛋白的溶液制备及组份分离［J］.高分子学报，2010(2):250-254.Guan Juan，Tian Kun，Yao Jin-rong，et al.Preparation of high molecular weight soy protein aqueous solution and separation of its main components［J］.Acta Polymerica Sinica，2010(2):250-254.