硼替佐米对大鼠肾移植AMR的保护作用及机制研究

黄耿文，丁 翔，雷 鹏

0 引言

抗体介导排斥反应(Antibody mediated rejection，AMR)是造成移植肾功能衰竭最主要的原因之一[1-2]。硼替佐米(Bortezomib)是蛋白酶抑制剂的代表性药物。有报道显示，硼替佐米可以抑制肾移植术后AMR的进程，缓解排斥反应所造成的移植肾功能损害，但其具体作用机制目前尚未阐明[3]。为此，笔者应用大鼠AMR肾移植模型，研究硼替佐米对肾移植AMR保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 AMR大鼠肾移植模型和实验分组

1.1.1 移植前致敏 移植前3周预先取供体Brown-Norway大鼠全血0.5 mL，肝素化后经由受体Lewis大鼠阴茎静脉一次性输入，以此诱导受体产生供体特异性抗体(Donor specific antibody，DSA)。

1.1.2 移植 MHC完全不相容的供/受体大鼠(Brown-Norway/Lewis)间进行肾脏移植，一期移除受体双侧肾脏。具体手术方法：动脉吻合采用腹主动脉-腹主动脉端侧吻合，静脉吻合采用肾静脉-下腔静脉端侧吻合，均用10-0 Nylon连续缝合；泌尿道重建采用输尿管-输尿管端端吻合，11-0 Nylon间断缝合4～5针，不放内支撑。所有手术均由第一作者完成，手术成功率在90%以上。

1.1.3 实验分组 分3组，每组6例。G1(假手术组)：受体大鼠仅做开腹关腹术；G2(AMR组)：按如上方法致敏和移植；G3(硼替佐米组)：按如上方法致敏和移植，移植手术前2 d起静脉注射硼替佐米(0.03 mg/kg，2次/周)直至动物死亡或术后1周。

1.2 血清标本检测 应用IDEXXVetTest化学分析仪检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)水平。血清DSA检测采用流式细胞仪。具体方法：取供体大鼠脾脏，制成单细胞悬液，与受体血清孵育。然后分别与FITC耦合的山羊或小鼠抗大鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG2c的单克隆抗体冰上反应30 min，PBS洗净，1%福尔马林固定后流式细胞仪(Becton-Dickinson)检测受体血清中DSA各亚型水平。

1.3 病理学检查 所有石蜡切片经H&E染色后由病理科医生按Banff标准单盲完成诊断和评分[4-5]。肾组织中C4d采用免疫组织化学法检测。一抗为兔抗大鼠C4d多克隆抗体(Hycult Biotech)。C4d阴性记为0分，局灶性阳性表达记为1分，弥漫性阳性表达记为2分。移植肾组织中巨噬细胞采用免疫荧光法检测。用小鼠抗大鼠CD68单克隆抗体(AbDSerotec)标记巨噬细胞。按显色细胞占细胞总数的比例分为弱(<30%)、中(30%～60%)和强阳性表达(>60%)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行分析。定量资料多组间比较采用单因素方差分析，半定量等级资料比较采用秩和检验。

2 结果

2.1 硼替佐米对肾移植大鼠肾功能的影响 术后1周硼替佐米组(G3)大鼠血清BUN和CRE分别为(33.17±0.15)和(0.75±0.04)mg/dL，而AMR组大鼠血清BUN和CRE分别为(48.33±0.17)和(1.30±0.05)mg/dL，假手术组则分别为(20.00±0.10)和(0.37±0.03)mg/dL，三组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组术后1周肾功能结果

2.2 硼替佐米对肾移植大鼠血清DSA的影响 见图2。由图2可见，术后1周硼替佐米组(G3)较之AMR组(G2)，血清IgM、IgG2b和IgG2c水平均显著下降(P<0.05)。

图2 硼替佐米对AMR肾移植大鼠血清DSA的影响

2.3 硼替佐米对肾移植大鼠肾脏病理损害的保护作用 见图3。如图3所示，AMR组(G2)大鼠移植肾脏呈现典型的急性AMR病理表现：肾小管周围毛细血管和间质内单核巨噬细胞浸润，肾小球内皮细胞块状缺失，肾小球内炎性细胞浸润等。硼替佐米组(G3)大鼠移植肾上述AMR表现明显减轻。

2.4 硼替佐米对肾移植大鼠肾脏C4d表达的影响 见图4。由图4可见，AMR组(G2)移植肾组织中肾小管周围毛细血管(PTC)上C4d均呈弥漫性表达，而硼替佐米组(G3)肾组织PTC上C4d均呈局灶性表达，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 硼替佐米对移植肾巨噬细胞浸润的影响 采用免疫荧光法标记肾脏组织中巨噬细胞(红色)，可见硼替佐米组(G3)大鼠移植肾组织中巨噬细胞表达呈中等强度表达，明显少于AMR组(G2)，AMR组均呈强阳性表达。见图5。

图3 两组肾脏典型病理改变(×200)

图4 两组肾移植大鼠肾脏C4d表达(×200)

图5 两组移植肾组织中CD68表达(×200)

3 讨论

AMR已成为目前临床上移植肾失功的主要原因之一[6]。由于缺乏针对AMR有效的药物，其较细胞排斥更难于治疗，且后果更为严重。目前AMR的治疗主要包括血浆交换和免疫吸附等方法，旨在迅速降低循环中既有的DSA水平。尽管如此，治疗效果仍不尽理想。因此，开发有效针对AMR的药物成为进一步提高肾移植患者术后长期存活的关键之一。

硼替佐米是一种强大的、可逆性的蛋白酶抑制剂，为FDA批准用于多发性骨髓瘤的治疗[7]。硼替佐米可以抑制NF-κB诱导的存活信号，降低分化的浆细胞中蛋白酶的活性[8]。越来越多的资料显示，硼替佐米用于临床上治疗顽固性AMR可以迅速降低血清DSA水平，改善移植肾功能，但是其具体机制目前并不清楚[3]。

本研究显示，硼替佐米可以明显抑制AMR大鼠血清中IgM、IgG2b和IgG2c等DSA亚型的水平，减少移植肾C4d的表达，显著改善肾移植大鼠的肾脏功能，并且显著减轻AMR大鼠移植肾的病理损害。表明硼替佐米具有抑制骨髓浆细胞产生DSA的能力，从而减轻DSA所诱导的补体激活及肾脏损害。最近的研究显示，单核巨噬细胞是肾移植AMR发生发展过程中最主要的效应细胞，是导致移植肾损害最重要的攻击细胞[9-12]。本研究显示，硼替佐米还可以明显减少移植肾组织中巨噬细胞的浸润。由此证明，硼替佐米对AMR移植肾的保护作用与其抑制移植肾组织中巨噬细胞的浸润有密切关系，其具体途径有待进一步研究。

参考文献：

[1] Mengel M,Husain S,Hidalgo L,et al.Phenotypes of antibody-mediated rejection in organ transplants[J].Transpl Int,2012,25(6):611-622.

[2] Djamali A,Kaufman DB,Ellis TM,et al.Diagnosis and management of antibody-mediated rejection:current status and novel approaches[J].Am J Transplant,2014,14(2):255-271.

[3] Nigos JG,Arora S,Nath P,et al.Treatment of antibody-mediated rejection in kidney transplant recipients:a single-center experience with a bortezomib-based regimen[J].Exp Clin Transplant,2012,10(6):609-613.

[4] Sis B,Mengel M,Haas M,et al.Banff ′09 meeting report:antibody mediated graft deterioration and implementation of Banff working groups[J].Am J Transplant,2010,10(3):464-471.

[5] Mengel M,Sis B,Haas M,et al.Banff 2011 meeting report:new concepts in antibody-mediated rejection[J].Am J Transplant,2012,12(3):563-570.

[6] Haas M.Pathological features of antibody-mediated rejection in renal allografts:an expanding spectrum[J].Curr Opin NephrolHypertens,2012,21(3):264-271.

[7] 熊文杰,冯春锐,凌燕,等.硼替佐米联合地塞米松治疗多发性骨髓瘤26例临床分析[J].中国医师杂志,2012,14(6):835-837.

[8] 庞丽萍,陈甜甜,徐海婵,等.硼替佐米联合地塞米松方案治疗多发性骨髓瘤分析[J].中国医药,2013,8(1):76-77.

[9] Sun HJ,Zhou T,Wang Y,et al.Macrophages and T lymphocytes are the predominant cells in intimal arteritis of resected renal allografts undergoing acute rejection[J].Transplant Immunol,2011,25(1):42-48.

[10]Sellares J,Reeve J,Loupy A,et al.Molecular diagnosis of antibody-mediated rejection in human kidney transplants[J].Am J Transplant,2013,13(4):971-983.

[11]Stegall MD,Chedid MF,Cornell LD.The role of complement in antibody-mediated rejection in kidney transplantation[J].Nat Rev Nephrol,2012,8(11):670-678.

[12]Salvadori M,Bertoni E.Impact of donor-specific antibodies on the outcomes of kidney graft:Pathophysiology,clinical,therapy[J].World J Transplant,2014,4(1):1-17.