伤寒实验室诊断的研究进展

周泽文，赵春茹，周敏

（右江民族医学院公共卫生与管理学院，广西 百色 533000 E－mail：13637891292＠126.com）

伤寒是一类由伤寒沙门氏菌感染引起的，以患者持续发热、神情淡漠、脾肿大、皮肤玫瑰疹、相对缓脉和全血白细胞减少等为主要特征的急性消化道传染病，其病理变化表现为全身单核－巨噬细胞系统的增生性反应，以位于回肠下段的淋巴组织增生及坏死为主要表现［1］。目前，肠道感染已成为世界排名第三的疾病病因，伤寒作为其中重要的疾病构成，伤寒沙门菌所引起的肠热症对人类的健康构成重大威胁［2－3］。然而，目前由于检测方法灵敏度的限制，临床上难以将伤寒与其他病原体特别是病毒引发的肠道感染区分开来，对疾病的诊断和治疗以及流行病学上的控制带来重大影响。现对伤寒的实验室诊断方法进行整理，综述如下：

1 细菌的分离培养

从体液标本中培养出伤寒沙门氏菌是目前伤寒诊断的最基本方法，也是诊断伤寒病例的金标准。按使用的标本不同，伤寒细菌的分离培养主要分为：血培养，骨髓培养，粪便培养，尿培养及其他。

1.1 血培养 血培养是目前应用最广泛的伤寒病原学诊断方法，具有简便、易行、特异性高的优点。然而，这一方法的阳性率容易受到抗生素使用的影响，对未使用抗生素的患者，一般阳性率在病程的前7d最高，可达80%～90%，到第14～21d可降至50%，随后迅速降低，而对于使用过抗生素的患者，检出率相应降低［4］。另外，随着检测技术的发展，近年来一些新的方法被用于提高伤寒血培养的阳性率，如溶血离心培养法，在血液中加入皂素、OP乳剂等溶解剂后加速振摇使血液溶解，经离心后对沉淀进行分离培养，这种培养法的阳性率要显著高于常规血培养法，且耗时较短。

1.2 骨髓培养 伤寒沙门菌属于胞内菌，不仅存在于网状细胞还存在骨髓中，单位体积血液中的细菌数明显少于骨髓。有数据显示，细菌在骨髓及外周血中的数量之比在病程第1～7d为4.8，到第14～21d升至158，由于骨髓中的细菌数受抗生素的影响相对较小，在患者病情后期及抗生素治疗后，骨髓培养法检出细菌的灵敏度仍较高，因此骨髓培养尤其适用于病程长和接受过抗生素治疗的病人［4］。

1.3 粪便培养 伤寒沙门菌在粪便培养中的敏感性既与病人的病程，抗生素使用情况及病人的个体因素有关，也与粪便培养的次数和数量密切相关。处于急性期的病人粪便培养阳性率小于30%，随病程延长，病原菌的检出率逐渐增加，到21～28 d的阳性率可高达75%［5］。另外，多次采样有助于检出带菌者。

1.4 尿培养 研究显示尿培养的阳性率较上述几种方法低，其中尿培养在病程的21～28d阳性率最高，但仍低于25%［6］，因此在临床上均不推荐使用。皮肤玫瑰疹的刮取液再培养的方法在临床上也偶有使用，但是不属于常规检查。

2 血清学方法

2.1 肥达试验 肥达试验用于伤寒的辅助诊断已有一百多年历史了，通常认为当肥达反应结果出现O 或H 抗体滴度大于1∶80或1∶160，或恢复期抗体凝集效价较急性期增高4倍以上则可判定肥达试验阳性，再结合临床症状即可诊断。然而由于这项实验本身的灵敏度、特异度均不高，受干扰的因素较多，而且临床上不易同时获得患者急性期和恢复期双份血清，因此，近年来，一系列基于抗原抗体检测的试验得以开发并用于取代肥达试验，如检测伤寒病原菌抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA），协同凝集试验（SPA－CoA），免疫荧光试验（IFA）以及检测抗体的间接血凝试验（PHA），杀菌抗体试验（BCAT）等。

2.2 基于抗原检测的试验

2.2.1 协同凝集试验（SPA－CoA） SPA 是金葡菌表面的A蛋白，具有结合伤寒杆菌抗血清中IgG 的FC 段的能力。利用SPA 能与患者血清或体液中相应抗原反应的特点，通过向患者血清或尿液中加入SPA 试剂，观察协同凝集反应是否发生来判断样本中病原菌抗原的存在，进而做出诊断。这一方法具有敏感性和特异性相对较高的特点。

2.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）及酶免疫斑点试验 相对于通过多克隆抗体检测患者血液、粪便、尿液中的病原菌抗原的肥达试验，用单克隆抗体检测伤寒病人体液中抗原的试验特异性更高，更具有临床应用价值。近年来，市面上已出现多种针对伤寒杆菌成分的单克隆抗体，并陆续用于临床诊断，使得伤寒免疫诊断的灵敏度和特异性大幅提高，较常见的有抗O9、Vi、以及Barbar蛋白及鞭毛的单克隆抗体。

酶联免疫吸附试验利用双抗体夹心法（Vi抗体包板及酶标Vi抗体）检测伤寒病人血清和尿液中Vi抗原，具有早期和快速的特点，敏感性较SPA－CoA 高5倍以上。另外，国外也有研究者利用此法检测患者血清中脂多糖抗体作为伤寒快速诊断的方法，研究显示该试验的敏感性和特异性均较肥达试验高，且可以用于单份血清的诊断［7］。

酶免疫斑点试验需要先将伤寒病人早期血清及尿液用乙醇及三氯醋酸进行处理，然后滴于硝酸纤维素滤膜上，封膜，加入伤寒沙门菌特异性Vi抗原的单克隆抗体。利用抗原抗体反应，结合酶标SPA 达到检测目的。此法具有快速、特异性强的优点，适用于伤寒早期的快速诊断。

2.3 基于抗体检测的试验

2.3.1 间接被动血凝试验（PHA） 该项试验使用伤寒沙门菌特异性Vi抗原，可溶性O 抗原，脂多糖抗原刺激人（O 型血）或绵羊红细胞发生变态反应，进而制备血凝抗原，使用该抗原与患者血清进行间接血凝试验，观察致敏红细胞的凝集反应滴度，判断是否有相应特异性抗体的存在。由于伤寒病人消菌治疗成功后，Vi－PHA 可以转阴，因此血清中Vi抗体的检测可用于伤寒带菌者的筛选以及用于伤寒消菌治疗的效果考评。

2.3.2 杀菌抗体试验 IgM 抗体出现在伤寒感染早期的患者血清中，具有强大的溶菌和杀菌能力，因而称为杀菌抗体，检测病人的血清中IgM 抗体，可用于伤寒感染的早期诊断。有研究指出，在伤寒发病后的2天即可检测出有临床指导价值的杀菌抗体［8］。

3 分子生物学检测

随着分子生物学技术的蓬勃发展，相应的分子生物学手段已逐渐进入伤寒的实验室诊断领域，目前国内外研究较多的有伤寒的基因探针检测、PCR 检测、蛋白芯片检测。

3.1 基因探针检测 基因探针是一段已知的，经生物素、同位素或荧光染料标记的寡聚核苷酸。基因探针检测就是利用分子杂交原理，通过探针检测样本中是否存在与其互补的基因的一种方法，自从问世以来，这种方法已广泛应用于多种病原微生物的检测。20世纪80年代，国外学者率先构建了沙门氏菌的特异性DNA 探针［9］，随后国内也有众多研究者开始构建用于伤寒检测的基因探针。由于放射性探针标记技术的费用较高，并且对人体健康有害，不能广泛用于实验室诊断，目前已被酶促化学发光反应的酶标技术代替。多项研究显示，酶标基因探针化学发光法检测伤寒杆菌的方法具有敏感性和特异性高的优点，同时由于其操作简便、快速、安全，具有良好的应用前景［10］。

3.2 PCR 检测

3.2.1 常规聚合酶联反应 伤寒沙门菌的鞭毛基因存在高度保守区域，因此可通过PCR 扩增出特异的DNA 片段，用于对伤寒早期作出快速诊断。聚合酶链反应的方法较肥达反应有较高的灵敏度和特异性，并且试验的周期缩短，可在伤寒感染的早期即可作出诊断，对接受过抗生素治疗的患者和怀疑已感染但血培养阴性的患者具有较大的实用价值。然而PCR 可因污染出现假阳性，并且试验操作相对繁琐，对环境要求较高，因此不能用于伤害诊断的大面积推广。

3.2.2 巢式PCR 巢式PCR 能够克服传统PCR 方法病原菌检出量低的不足，可直接从临床血液标本中检出病原菌，整个过程耗时短，是一种快速、敏感和特异的的伤寒早期病原菌检测方法。十多年前国内已有很多研究者根据伤寒杆菌特异的的鞭毛基因序列设计引物，利用此法快速检测血液中的伤寒沙门菌，结果均证实巢式PCR 较传统PCR 具有更大的潜力用于快速检测伤害杆菌［11－12］。

3.2.3 多重荧光PCR 与传统PCR 每个反应只能扩增1个模板、反应产物需要进一步凝胶电泳分析、易出现交叉污染不同，多重荧光PCR 具有方便快速、特异性高、操作封闭和反应产物不需要PCR 后处理的优点，是目前公认的同时具有高敏感性和高特异性的检测方法，已广泛用于微生物的检测。马淑贞等用多重荧光PCR 方法对伤寒，甲乙丙型副伤寒进行评估得出该方法检测伤寒、副伤寒沙门菌的灵敏度和特异度分别高达100%、98.2%的结论［13］，提示多重荧光PCR 法可用于伤寒病原菌的快速检测，适用于临床伤寒的早期快速分型诊断。

3.3 蛋白芯片检测 蛋白质芯片技术的发展为大面积，高通量样本的检测提供了有效手段。蛋白芯片技术不光有利于伤寒的诊断，还可用于伤寒感染患者的型别分析，为进一步的临床治疗提供指导依据。彭杰雄等［14］利用蛋白芯片技术将副伤寒抗原（Ta、Tb、Tc）与伤寒抗原To、Th及Vi伤寒荚膜多糖抗原一同检测，结果显示该方法的灵敏度、特异度可分别高达97.6%、98.0%。由于Vi荚膜多糖抗原可用于筛选带菌者，而蛋白芯片技术具有速度快，效率高的特点，因此利用蛋白芯片技术检测伤寒特异性抗原可将带菌者从大规模的食品从业人员中快速筛出。

4 其他

除了上述实验室病原学检查方法外，骨髓涂片检查戒指样组织细胞，B细胞和T 细胞等形态学和免疫学检查均有用于伤寒诊断的报告。另外，影像学检查对于伤寒的辅助诊断也具有较大意义。

4.1 骨髓涂片查找伤寒细胞 通过对伤寒和非伤寒患者的骨髓涂片进行比较，我国研究者发现了伤寒的特异性戒指样组织细胞，命名为伤寒细胞。通过多项试验证实，伤寒细胞具有极高的指示作用，与细菌培养及肥达反应相比，骨髓涂片查找伤寒细胞敏感性更高，且出现具诊断价值指标的时间更早。提示此法可用于伤寒的早期诊断，同时由于这项方法操作简便，设备要求简单，因此具有极大的临床实用性。

4.2 影像学检查 全身范围内的网状内皮系统发生增生，特别是回肠下端发生增生是伤寒的显著病理特征。利用高频B超可以清楚检测到肠壁的增厚范围、厚度及是否存在回盲部的肿大淋巴结等情况。伤寒病程的前两周80%以上的病人会出现回盲部淋巴结肿大及回肠末端肠壁增厚的病理表现［15］，因此结合临床表现，B超也可用于伤寒的早期诊断。

综上所述，目前实验室诊断伤寒的方法众多，但每种方法均各有其优缺点。随着当代分子生物学理论与技术的不断发展以及新型检测仪器和试剂的研发，伤寒的实验室诊断方法将逐步朝着早期、迅速、高敏、特异等方向快速发展，这些检测技术的日臻成熟将为伤寒临床诊断提供更加有效的科学依据。

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