岩黄连引种栽培组织培养化学成分及提取测定研究进展①

陆瑞群，林艳明，庞广福

（右江民族医学院，广西 百色 533000）

岩黄连（Corydalis Saxicola Bunting），全草含脱氢卡维丁（岩黄连碱）等活性成分［1］，具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，并有抑制肿瘤细胞作用；主治疮疖肿毒、肝炎、肝硬化、肝癌等症，因此，对岩黄连进行研究有着重要的意义。岩黄连为岩溶石山地区特有的多年生草本药材植物，局限分布裸露石山，生于石缝、石穴。由于生长环境条件恶劣，岩黄连自然繁殖率很低，种群发展困难，资源蕴藏量十分有限［2］。本文对岩黄连的引种栽培、组织培养、化学成分、提取分离及含量测定的研究进展进行了概述。

1 引种栽培

1.1 种子繁殖研究 蒋运生等［3］对岩黄连的种子研究发现，三种不同的贮藏种子的方法当中，以纸袋密封置于低温贮藏最好，发芽率最高，为25.75%；来自岩黄连果穗基部、中部和顶部的种子，以着生在中部的发芽率最高，为28.75%；不同类型的播种基质中，以火土加肥泥，发芽率最高，为21.25%。

1.2 栽培研究 蒋水元等［2］曾报道，岩黄连对温度的适应性较广，在－4.2℃～39.4℃范围内未表现出受危害症状，最适宜植株生长的温度为10℃～20℃；岩黄连对水分条件的要求是耐旱而怕淹窒，但充足的水分更有利于植株的生长；岩黄连对光照条件的要求是耐弱光而忌强光；岩黄连对黑色石灰土和酸性红壤都有较强的适应性，以有机质含量丰富、疏松、排水良好的沙壤土或轻壤土为佳。

岩黄连主要以种子繁殖，一般每年3～4月份起播种育苗，60d后可移苗栽植。适合生长在碱性的沙壤土，特别是在温度适宜、土质肥沃、光照适度、空气清凉的岩洞内。种植两年后可进入盛产期［4］。蒋水元等［5］曾报道岩黄连的种植方法，包括种苗繁殖技术、栽培定植技术以及田间管理技术。韦忠福等［6］也对岩黄连的种植栽培技术进行了介绍，包括生产基地的选择、种苗的培育、定植，以及田间管理。

1.3 岩黄连的病害及防治 陈元生等［7］曾报道岩黄连主要有茎基腐病、灰霉病、病毒病三种病害以及对这三种病害的综合防治措施。蒋水元等［5］曾报道岩黄连的主要病害有猝倒病（病原：鞭毛菌亚门真菌的瓜果腐霉菌）、白粉病（病原：子囊菌亚门白粉菌属真菌）和茎基腐病（病原：半知菌类葡萄孢属、子囊菌门葡萄核盘菌属）。可通过苗床土壤消毒、喷药防治、生态防治以及加强栽培管理等方法进行病毒防治。

1.4 人工栽培药材与野生药材的主成分量比较 黄玮等［8］采用高效液相色谱法以及紫外分光光度法分别测定岩黄连药材中的脱氢卡维丁以及生物总碱，发现人工栽培的岩黄连药材所含的脱氢卡维丁以及生物总碱均比野生岩黄连要高。

2 组织培养

程华等［9］分别用岩黄连的叶、茎、根作为外植体诱导愈伤组织，发现叶片诱导率最高，诱导速度最快，表明叶片最适合诱导愈伤组织。陆瑞群［10］对岩黄连的组织培养进行了初步研究，发现岩黄连种子的萌发需要经过低温的诱导，种子萌发率为69.2%。在消毒时间对茎尖消毒效果的影响实验中，得出较好的灭菌时间是6min，此时茎尖的成活率为30%。另外研究发现，B5是较好的诱导芽的培养基。在不同BA浓度对丛生芽诱导的实验中，得出较适合岩黄连继代培养的培养基为 MS＋BA0.1＋NAA0.01。在不同浓度TDZ对诱导芽的影响的实验中，发现较好的诱导丛生芽的培养基为 MS＋TDZ0.2＋NAA0.01。在不同浓度聚乙烯醇（PVA）对岩黄连玻璃化苗逆转影响的实验中，PVA浓度为2g／L时，逆转率最高为20%。苏江等［11］研究发现，叶柄和叶片的愈伤组织诱导率明显高于茎节和茎尖，其中叶片诱导率最高为46.67%，而茎尖愈伤组织的再分化率最高为66.7%。

3 化学成分

从岩黄连中分离鉴定出的化合物有：小檗碱（berberine）、脱氢卡维丁（dehydrocavidine）、卡维丁［（±）cavidine］、β－羟基白屈菜红碱（chelerythrine）、（—）斯库来碱［（—）scoulerine］、原阿片碱 （protopine）、白 蓬 叶 碱 ［（＋）thalictrifoline］、沙 明 碱（corysamine）、非 洲防己碱（columbamine）、去 氢 碎 叶 紫 堇 碱（dehydrocheilanthifoline）、黄 连碱 （coptisine）、去氢岩 黄 连 碱（dehydrocavidine）、齐墩果酸（oleanolic acid）、刺檗碱（oxvacanthine）、胡萝卜苷（daucosterol）、别隐品碱（allocryptopine）、β－谷甾醇（β－sitosterol）、白桦脂醇（betulin）、环桉烯醇（cycloeucalenol）、白桦脂酸（betulinic acid）、β－香树脂醇乙酸酯（βamyrin acetate）、四氢掌叶防己碱（tetrahydropalmatine）、巴马汀（palmatine1）、1－硝基阿卟卡维丁、8－羟基－9－甲氧基－11－硝基－利瑞尼碱、脱氢异阿卟卡维丁、3－甲氧基－2，9，10－三羟基四氢原小檗碱、5－甲氧－6－甲基吲哚－1－甲醛、2羟基－5－甲氧－6－甲基吲哚－1－甲醛、（－）－2，9－dihydroxyl－3，11－dimethoxy－1，10－dinitrotetrahydroprotoberberine、（＋）－4－nitroisoapocavidine［12－15］。

4 提取分离

李倩霞等［16］研究大孔吸附树脂分离岩黄连总生物碱，提取工艺为：上样药液原药材浓度0.2g／ml，吸附流速为2BV／h，解吸附溶剂为60%乙醇（3BV），所得岩黄连提取物中总生物碱含量大于60%。王静等［17］用正交实验优选岩黄连药材的最佳提取工艺，提出最佳工艺条件为：用75%乙醇提取，每次加醇量10倍，提取3次，每次提取时间2h，优选得到的工艺简便、稳定、可行。蒋伟哲等［18］用醇—酸水—氯仿的方法从岩黄连中提取出总生物碱，然后采用制备色谱系统从中分离出岩黄连碱，产品经HPLC检测质量分数达99%以上，而且该方法先进，重复性好。刘朝亮等［19］采用高速逆流色谱法制备分离岩黄连中的脂溶性生物碱，快速、简便、产物得率和纯度较高。其工艺条件为：正己烷－醋酸乙酯－甲醇－水（3∶7∶5∶5；1.5∶5∶1.5∶5）、正已烷－醋酸乙酯－甲醇－0.2mol／L盐酸（1∶3.5∶2.5∶4.5），上相作固定相，下相作流动相，转速860r／min，流速1.2ml／min。Deng J等［20］研究发现应用微波联合高速逆流色谱法可有效地提取、分离和纯化脱氢卡维丁。梁镇然等［21］用高速逆流色谱与硅胶柱层析联用分离岩黄连中的2种原小檗碱型季胺生物碱，该方法降低了反复的柱层析导致的样品损失。

5 含量测定

对岩黄连总生物碱或岩黄连有效成分的含量测定主要有四种方法：高效液相色谱法（HPLC）、反相高效液相色谱法（RP－HPLC）、高效液相色谱－质谱法（HPLC－MS／MS）及分光光度法，其中使用较多的是高效液相色谱法。陆益等［22］用HPLC法测定岩黄连中不同部位脱氢卡维丁的含量，采用Zorbax ODS C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈—0.05mol／L磷酸二氢钾溶液（用10%KOH调pH 至5.0）（85∶15）为流动相，流速1.0ml／min，检测波长为347nm，柱温为室温。结果：脱氢卡维丁在2.51～75.36μg／ml（r＝0.99999，n＝7）范围内线性关系良好，平均回收率为99.86%，RSD为0.58%，该法简单、快速、重现性好，适用于岩黄连中脱氢卡维丁的定量分析。罗远秀等［23］用HPLC测定岩黄连注射液中岩黄连碱的含量，方法：Luna C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈－水（1∶1，1 000ml含磷酸二氢钾3.4g，十二烷基硫酸钠1.7g），流速1.0ml·min－1，检测波长347nm，柱温为室温。结果：岩黄连碱在5.48～49.34μg·ml－1浓度范围内呈良好的线性关系（r＝1.0000）；平均加样回收率为99.96% ，RSD＝0.41%（n＝6）。黄雪梅等［24］采用反相高效液相色谱法对岩黄连碱进行含量测定。结果：岩黄连碱进样量在0.106～2.12 μg范围内，与峰面积分值呈良好的线性关系（r＝0.9999）；平均加样回收率为100.83%（RSD＝1.15%，n＝5）。程华等［25］用分光光度法测定岩黄连不同部位总生物碱的含量。采用氟仿超声提取岩黄连不同部位样品，依据酸性染料比色法的原理，以盐酸小檗碱为对照，溴甲酚绿为指示剂，在416nm波长下比色测定样品中总生物碱含量。结果吸光度值与生物碱含量线性关系良好（r＝0.9991）；回收率为101.91%，RSD为1.75%；测定结果在3h内稳定，RSD为1.09%。龚志强等［26］用HPLC测定广西4个产地野生岩黄连药材中脱氢卡维丁的含量，发现广西4个不同县产岩黄连药材脱氢卡维丁含量差异明显。

6 展望

目前，对岩黄连的研究已经涉及引种栽培、生药鉴别、植物生理、细胞培养、组织培养、化学成分、提取分离、含量测定、药理作用、临床应用及基因组DNA等方面，研究面较广但是研究深度不够。有关岩黄连研究的文献资料还相对较少，这可能与岩黄连的生境条件恶劣以及资源蕴藏量低有关。在岩黄连的引种栽培过程中应当实行规范化种植，加强良种选育、无公害病虫防治方面的研究；在组织培养方面，还需继续研究，找到适合规模化生产的配方和条件；对岩黄连化学成分的研究主要集中在生物碱成分的研究，而对无机成分、氨基酸、糖类等成分的研究较少；在提取分离方面，还需继续研究，找到适合规模化生产的方法和工艺条件。

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