胶原蛋白的应用研究及存在的问题

王艳芳，李世财，刘亚林，张 玲，李清梅

(1.吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，130033；2.吉林农业大学中药材学院，130033；3.吉林农业大学生命科学学院，130033)

1.胶原蛋白基因的来源及结构特征

1.1 胶原蛋白的来源

据科学研究胶原蛋白是肉食性动物特有的蛋白质，是动物体内含量较高的一种蛋白质，广泛的分布在动物的结缔组织中，也是人体内蛋白质的重要组成部分，约占人体蛋白质的三分之一。畜禽类动物一直是人们获取天然胶原蛋白的主要途径，但由于近些年各种疾病的出现使人们对陆生动物胶原蛋白及其制品的安全性产生了质疑，因此人们将开发胶原蛋白的目光转向了海洋生物。我们都知道地球百分七十是海洋，并且海洋生物资源丰富，而在许多海洋生物中各种鱼类胶原蛋白含量都比较高，尤其是海洋生物加工废弃物--皮、骨、鳞中所含有的胶原蛋白。食品科学杂志报道了一种提取牛皮中胶原蛋白的新方法--酸酶复合法,该法工艺简单,在相对较短的制备时间内,胶原蛋白的提取率可达54.5%，在食品工业科技上报道用酶解法提取安康鱼中的胶原蛋白的平均提取率达11.01%，纯度可达96.5%，热力法提取鱼鳞胶原蛋白含量达45.74%，大连工业学报上记载用热水法提取鳕鱼胶原蛋白的最优提取率可达83.75%[1]。

1.2 胶原蛋白基因的结构

近些年随着DNA 重组技术、DNA 探针的出现使人们对胶原蛋白基因有了初步研究,人们开始了探索胶原蛋白基因结构的旅途，并获得了一些它们在染色体上的定位资料。目前知道已有4 种胶原基因都含有一个TATA 序列,位于转录起始点5'端20-30b 处。E.Avvedimento,Y.Yamada 及M.Mudryj 等人对胶原蛋白基因的某些表达子的大小及一级结构等特性进行了研究,结果表明: 表达子的大小有明显的保守性,12 个表达子中有四个大小相同(5 4 碱基对),2 个表达子由108 个碱基对组成,恰是54 的二倍。值得指出的是, 虽然大多数表达子长度相同(54 个碱基对),但除了甘氨酸的密码子(GGx)每隔二个三体码出现一次外,表达子内的核普酸序列不尽相同。另一个特点是, 所有的表达子的碱基对数都是9 的倍数, 这是因为为保持三螺旋的连续性, 只有缺失9 个碱基对或是9 的倍数才是可行的,确实胶原蛋白分子的基本重 复单位qly - x -y 是由9 个碱基所编码[2]。而I 型胶原蛋白的基因长约4okb，包含52个外显子，编码的单体肽链包含1464 个氨基酸残基。单体的胶原多肽链由粗面内质网上的核糖体所合成，其前体a 链上含有1 个22 氨基酸残基的信号肽序列，该信号肽序列为内质网膜上的信号肽受体所识别，在一些移位子的帮助下可穿过ER 膜进入ER 腔中，前体链上的信号肽被ER 腔中的信号肽酶切割形成原胶原的单体分子结构。原胶原分子在分泌出细胞之前，在ER中还要经历一系列翻译后的修饰过程。据报道新合成的原胶原多肽链进入ER 腔以后至少受到9 种分子伴侣与酶的作用。多肽链中的脯氨酸与赖氨酸要被脯氨酸3 位羟化酶、脯氨酸4 位羟化酶及赖氨酸4 位羟化酶有选择性地羟基化，这3 种酶都需要铁离子、2-酮戊二酸、分子氧以及抗坏血酸作为其辅助因子。I 型原胶原蛋白分子中大约有50%的脯氨酸残基在4 位含有1个羟基，脯氨酸的羟基化程度有种属的差异，生活在低温环境中的动物，其胶原蛋白上的脯氨酸羟基化程度较低，脯氨酸的羟基化对于原胶原单体之间形成氢键是必需的，因而对于胶原三螺旋结构域的热稳定性具有相当大的作用[3]。

2.胶原蛋白的结构及性质

胶原蛋白属于细胞外基质蛋白，呈白色，含有丰富的氨基酸--甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和谷氨酸（Glu）等18 种氨基酸，特别是甘氨酸含量最高，约占总氨基酸的27%，且每隔两个氨基酸残基（X，Y）即有一个甘氨酸，故其肽链结构可用（Gly-X-Y）n 来表示，还含有在其它生物体内少见的羟脯氨酸。胶原蛋白是由3 条α 链多肽组成,每一条链都是左手螺旋构型,3 条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构,即超螺旋结构，使其蛋白结构更加稳定。常见类型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，因其各种类型胶原蛋白具有良好的生物性能，因此在食品、医药、化妆品等领域被广泛的应用。

3.胶原蛋白的表达

实验室中大肠杆菌是基因表达的重要工具，将胶原蛋白基因运用基因手段使其在大肠杆菌中表达，收获的胶原蛋白含量可观，并且运用大肠杆菌做宿主的遗传背景相对比较清楚，表达易于控制，且大肠杆菌易于培养，可以获得较高产量的胶原蛋白[4]。早在1980 年，Uit toJ 等就从人的皮肤细胞体外培养中获得到了Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白。1997 年，在芬兰Oulu 大学胶原蛋白研究中心在研究人的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白全序列的毕赤酵母表达中取得较大的成功。经过大量研究表明了胶原蛋白与脯氨酸羟化酶在宿主细胞的共表达是一个很好的策略。1999 年BruinEC 等人使用汉森酵母和毕赤酵母作为宿主，表达人类Ⅰ型胶原蛋白的肽链，并做了相关研究，发现使用胶原蛋白自身的信号肽能使汉森酵母表达并分泌重组蛋白，却不能使毕赤酵母分泌重组胶原蛋白。NokelainenM 等人使用两种杆状病毒转染的昆虫细胞生产类人特异性软骨胶原Ⅱ型，表达出具有稳定三维结构的蛋白,产量达到50mg/mL。通过DD-PCR 得到人I 型胶原蛋白基因。该基因的读码框长4395bp,编码1464 个氨基酸,编码蛋白分子量约139.01kD。该基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织,并且在食管癌组织中的表达差异较胃癌中更明显。人I 型胶原蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表达,推测其可能在胃癌及食管癌的发生发展中起作用[5]。

4.胶原蛋白的相关产品及应用

随着人们对胶原蛋白需求量的逐渐增多，提取胶原蛋白的方式已经不能满足日益增长的胶原蛋白市场的需求，于是新的生产胶原蛋白的方法-生物反应器，不仅满足了人们对胶原蛋白量的需求而且更加安全可靠，从而使胶原蛋白在各个领域得到了广泛的应用。

4.1 食品产业

民以食为天，我们就先来探讨一下胶原蛋白在食品领域的重要应用。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质,其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。含有人体内重要的必需氨基酸和非必需氨基酸如甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等，因此对人体有重要的作用。

4.1.1 肉制品和肉制品的包装材料

胶原蛋白的水解产物-明胶，通过破坏胶原蛋白分子间的氢键，使其原有的超螺旋结构被破坏，形成结构较为松散的小分子。加入肉制品中可以改善结缔组织的嫩度，使其具有良好的品质,增加蛋白质的含量。并且添加在肉质食品中色泽鲜艳，易于被消费者所接受。因其具有紧密的螺旋结构，从而显示出很强的韧性和强度，氨基酸组成又使其具有优良的成膜能力。这些有利条件促成了其在食品包装材料中的应用。可制成的肉类、鱼类的包装纸、涂抹层及可食包装膜，具有良好的抗拉强度、热封性、阻气、阻油、阻湿性，可防止食品吸潮或干缩变形[6-7]。

4.1.2 冷冻食品

小孩经常吃的果冻、雪糕、冰激凌等食品中即是以胶原蛋白为胶冻剂，具有熔点低、入口即化的特点，因此可做为冷冻食品的改良剂，避免食品氧化、抑制褐变反应。

4.1.3 饮料、酒类食品

据有关文献报道饮料、酒类食品的澄清剂，大多是胶原蛋白制成的，在发酵产业中应用尤为广泛，特别是作为发酵后期除去酒中的一些胶体悬浮物的最佳澄清剂。鱼胶是国际上公认的高级澄清剂, 在啤酒和葡萄酒行业中取得十分好的效果，产品质量也非常稳定。在果酒酿造过程中也起到增稠剂、乳化剂、稳定剂、澄清剂等作用。在茶饮料的生产中，明胶又可防止茶饮料长期存放引起的混浊，改善茶饮料品质的目的。

4.1.4 保健食品

胶原蛋白能够为人体胶原蛋白的合成提供优质的氨基酸原料，尤其是脯氨酸和羟脯氨酸，促进胶原蛋白的合成，及时补充人体皮肤流失的胶原蛋白，有助于维持皮肤中胶原蛋白的特殊网状结构，从而达到改善皮肤水分，延缓皮肤衰老的作用。目前，以胶原蛋白为主要原料开发的保健食品日益受到广泛的认可，更高层次的符合了现代人“从内到外”对美丽的追求[8]。

5.2 化妆品上的应用

胶原蛋白作为一种新型的化妆品原料，对人体皮肤和毛发均有较好护理效果。许多高档化妆品中都添加有胶原蛋白，它为皮肤提供必需的营养成分，补充多种氨基酸，加强了皮肤的活性，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢。市面上含胶原蛋白的化妆品品牌Col ly Pink、派高、HR 眼霜和面霜、SISLEY 胶原蛋白霜、DR.CILABO 海洋胶原蛋白霜、HR 赫莲娜胶原蛋白、活肤乳液Avon、雅芳青春养颜洁面乳、Avon 雅芳青春养颜除皱精华、贝健鱼蛋白片、全金胶原蛋白粉、建泰尔胶原蛋白等。由于胶原及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性好，可以扩散到皮肤的深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；许多种胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分化、分裂、增殖有关，能提供皮肤的养分，延缓皮肤衰老，促进皮肤创面修复；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业[9-11]。

4.3 生物医学材料

近些年胶原蛋白广泛的应用到生物医学材料中，用胶原蛋白制成的胶原蛋白海绵、丝线和薄膜，主要用于外科止血，在皮肤医学上胶原蛋白制成的伤口敷料和人工皮肤用于伤口愈合，血管和心瓣膜用于心脏外科手术，胶原蛋白膜用于口腔外科、促进牙周键膜再生和口腔吸收性覆料，药物投递辅助机制用于生长素、生化大分子和质体基因投递工具;胶原蛋白基质膜板用于植入细胞作为组织、器官再生的模板。

4.4 制药领域

属于药物输送系的干扰素缓释药剂和性器官疵症治疗缓释剂，风湿性关节炎治疗用药、转基因动物由乳中生产人类胶原蛋白用以调制药剂，胶原蛋白发酵制成的降血压剂；组织工程用胶原蛋白制成人工皮肤、人工食道、人工器官、烧伤保护膜等；人工骨即在骨生长因子中混合胶原蛋白膜、组织与骨修复用胶原蛋白和骨骼修复剂；胶原蛋白药剂也可制成膀胱失禁用药；美容外科用胶原蛋白整形。

5.胶原蛋白的发展前景

胶原蛋白作为一种天然的生物资源，具有高分子材料无法比拟的生物相容性和可降解性，广泛的应用在食品、医学、保健和化妆品等领域中。随着我国科技进步、经济发展及人民生活水平的提高，对于外在美和内在美越来越重视，人们将焦点聚集到了胶原蛋白上。对胶原蛋白及其制品的深入研究和生产工艺的不断改进, 越来越多胶原蛋白产品将满足人们的不同需求, 特别是用在生物医学领域的胶原蛋白制品将会不断出现。胶原蛋白将会更广泛地造福人类，成为人们日常生活不可或缺的一部分。

6.胶原蛋白目前在表达和应用上存在的问题

随着胶原研究领域的蓬勃发展，发现了许多不同类型的胶原。这些胶原蛋白都有独特且重要的生物功能，为人类提供重要各种产品，同时由于不同胶原蛋白基因的突变也引起了的人类疾病的剧增。尽管研究工作已经有了很大的进展，但许多问题，如除常见的几种胶原蛋白外其他类型胶原的结构和功能、控序列，明胶结构的基本特性和胶原-明胶的转化，胶原蛋白的调控序列具体过程等目前还无法回答。

6.1 表达上的问题

胶原蛋白基因的表达是其本身的顺式作用元件、反式作用元件以及诸多调控因子相互作用的结果。并且几个胶原蛋白的第一个内含子都含有调控序列。胶原蛋白基因的表达是其本身的顺式作用元件、反式作用因子以及诸多调控因子相互作用约结果。在众多的调控因子中,ILJ、TGF-β、肝纤维化因子等属于正调节因子，能够刺激胶原基因的转录；而γ-INF、PGE2 固醇类激素等属于负调节因子，在一定程度上抑制了胶原基因的转录；但对于胶原蛋白的各个转录因子和调控因子的作用机制及其转录机制和速度等问题有待进一步研究[12]。对I 型胶原蛋白基因的功能、I 型胶原蛋白基因在其他恶性肿瘤中是否也高表达以及在胃癌及食管癌中具体通过何种途径发挥促癌作用等方面进行的深入研究,将会有利于解析肿瘤形成、发展的机制，从而从根本上解决癌症问题。

6.2 应用上的问题

胶原蛋白其实就是一种蛋白质，被分解为氨基酸后，其胶原蛋白的形态和结构已不复存在，也不可能直接以胶原蛋白的形式补充到皮肤中，因此开发一种承载胶原蛋白的载体已成为研究胶原蛋白药物应用的当务之急。由于胶原蛋白热使有些厂家在胶原蛋白类食品、化妆品、药物方面大做文章，对消费者造成一定影响，再加在利润的诱惑下使有些商家在提取胶原蛋白工艺上偷工减料，使其产生一些有害的物质，对人们身体健康造成了很大的影响。因此对胶原蛋白知识的普及应该得到重视[13]。

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