结核病生物诊断试剂豚鼠模型建立

龚宝勇，吴玉娥，黄姣艳，崔玉华，张 钰

(1. 广东省实验动物监测所，广州 510663；2. 广东省实验动物重点实验室，广州，510663；3. 广东瀚森生物药业有限公司，东莞 523808)

结核病是由结核分枝杆菌引起的人畜共患慢性传染病，在世界范围内具有高致病性和致死性。有关结核病的各项研究已成为全球学者关注的热点，特别是结核病生物诊断试剂的研究和开发[1]。结核病生物诊断试剂的上市和临床应用必须经过动物模型评价，因此建立合适的结核病生物诊断试剂模型，可避免人体试验的风险，还可严格控制实验条件，增强实验材料可比性和重复性，有利于更全面认识生物诊断试剂的有效性和安全性[2]。豚鼠对结核分枝杆菌高度敏感，迟发型超敏反应非常强烈，已经被广泛应用于抗结核药物和相关生物制剂检测中，成为人类结核菌素皮肤试验效能和结核检测生物制品鉴定效价的金标准[3-5]，而且根据《中国药典》2010版第三部，必须应用致敏豚鼠来评价体内诊断类结核病生物诊断试剂[7]。本研究旨在探索不同灭活H37Rv全菌体致敏剂量和致敏次数及皮试次数对模型结果的影响，为建立更简单、安全、可靠的结核病生物诊断试剂模型提供参考。

1 材料和方法

1.1 注射菌液制备

H37Rv菌株用Middlebrook 7H11培养基培养21 d，收集菌体，PBS洗3次，115℃，10 l b灭活30 min，干燥，放于4℃冰箱备用。称取灭活H37Rv全菌体，加入注射用生理盐水和等量弗氏不完全佐剂，研磨均匀乳化至滴入清水不散开。共配成3个剂量组：0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL，现配现用。

1.2 实验动物

SPF级Hartley豚鼠，雌雄各半，35～45日龄，广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2008-0002。动物饲养于屏障动物实验室，实验动物使用许可证编号：SYXK(粤)2012-0122，饲养管理严格按照《实验动物饲养管理和使用指南》进行。

1.3 致敏和皮试

致敏剂量评估：豚鼠检疫适应7 d后，分为3组(0.2 mg/mL剂量组、0.3 mg/mL剂量组、0.5 mg/mL剂量组)，每组44只，雌雄各半，每只豚鼠大腿内侧腹股沟皮下注射相应剂量灭活H37Rv全菌体0.5 mL，分3个位点进行注射。致敏后第5周背部剃毛，皮内注射0.1 mL(5IU)标准结核菌素(TB-PPD)进行皮试。皮试后24 h、48 h各观察豚鼠1次，测量、记录皮试红斑硬结的纵横径值，对各组结果进行统计分析。

致敏次数评估：选择8只豚鼠，雌雄各半，接种0.5 mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏，每次0.5 mL，每周1次，持续3周。首次致敏后第5周背部剃毛，皮内注射0.1 mL(5 IU)标准结核菌素(TB-PPD)进行皮试。皮试后24 h、48 h各观察豚鼠1次，测量、记录皮试红斑纵横径值并计算统计其均值，与致敏剂量为0.5 mg/mL致敏1次的豚鼠进行比较。

皮试时间评估：选择8只豚鼠，雌雄各半，0.3 mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏，致敏后第5、7、9、11周背部剃毛，皮内注射0.1 mL(5IU)标准结核菌素(TB-PPD)重复进行皮试。比较不同皮试时间红斑的纵横径值。

1.4 观察指标

致敏后每周1次称量豚鼠体重，连续5周，制作体重生长曲线；致敏后每周观察豚鼠腹股沟皮下注射部位溃烂情况，连续5周。皮试后24 h、48 h各观察豚鼠1次，测量、记录皮试红斑的纵横径值并计算统计其均值。

1.5 判定依据

根据《中国药典》2010版第三部，致敏豚鼠应用标准结核菌素(TB-PPD)皮试后24 h红斑纵横径值应大于5 mm，才能用于评价体内诊断类结核病生物诊断试剂[7]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 致敏豚鼠体重变化情况

不同剂量灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠后，动物饮食、饮水正常，体重持续增加。在致敏后第5周，0.2 mg/mL剂量组、0.3 mg/mL剂量组和0.5 mg/mL剂量组平均体重分别为：(478.7±38.5)g、(493.0±53.0)g和(490.6±43.5)g，与初始平均体重比较，体重分别增加了158.6 g、142.1 g和195.7 g。结果见图1。

图1 不同剂量灭活H37Rv全菌体致敏后豚鼠体重曲线

2.2 不同剂量致敏豚鼠后注射部位变化

豚鼠注射0.5 mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏后，注射部位出现硬节和溃烂。溃烂出现的时间在致敏后第4周，有18.9%的豚鼠发生溃烂，第5周有33.3%的豚鼠发生溃烂，在整个实验周期内溃烂不会愈合。见图2。

2.3 不同剂量灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠后红斑纵横径值比较

皮试后24 h，0.3 mg/mL组和0.5 mg/mL组皮肤红斑纵横径平均值均小于0.2 mg/mL组(15.4±2.3)mm，三组比较，差异有显著性(P≤0.05)。皮试后48 h，3个剂量组皮肤红斑纵横径值比较，差异无显著性(P≥0.05)。结果见表1。

2.4 多次致敏和单次致敏皮肤红斑纵横径值比较

实验结果显示，采用0.5 mg/mL 致敏剂量连续三次致敏豚鼠，皮试后24 h和48 h红斑纵横径均值与单次致敏豚鼠的红斑纵横径均值相比较无显著性差异(P>0.05)。结果见表2。

2.5 不同皮试次数红斑纵横径值比较

实验结果显示，采用0.3 mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，第1次皮试后24 h红斑纵横径值大于第2次、第3次和第4次皮试后红斑纵横径值，各组间比较有统计学差异(P≤0.05)；皮试后48h测量发现第2次皮试后红斑纵横径值显著低于其它3次皮试后红斑纵横径值( (P≤0.05)，结果见表3。

表1 灭活H37Rv全菌体不同致敏剂量皮试红斑纵横径值比较

表2 0.5 mg/mL灭活H37Rv全菌体3次致敏与单次致敏豚鼠皮试红斑纵横径值比较

表3 0.3 mg/mL灭活H37Rv全菌体致敏后不同皮试次数后红斑纵横径值的变化

3 讨论

自从结核菌素反应被罗伯特·科克在一个世纪前发现以来，豚鼠就成为研究迟发型致敏反应(DTH)的动物模型，且其DTH反应与人类进行的TB-PPD皮试反应非常相似[6]。根据《中国药典》2010版第三部，必须应用豚鼠来评价体内诊断类结核病生物诊断试剂[7]。

我们的研究结果显示，采用0.2 mg/mL H37Rv灭活全菌体单次致敏豚鼠，24 h和48 h皮试红斑纵横径均值分别为15.4±2.3 mm和11.0±2.2 mm，达到《中国药典》2010版第三部规定的“致敏豚鼠皮试后24 h红斑纵横径值应大于5 mm”的判定要求。张灵霞等[11]采用0.1 mL (5 mg)灭活H37Rv全菌体连续4次致敏豚鼠，皮试后24 h和48 h红斑纵横径均值分别为(8.25±1.73)mm和(7.41±1.22)mm，小于我们的致敏结果。我们分析此模型皮试反应强度较弱可能与其未使用弗氏不完全佐剂有关。Suely S. Kashino等[8]应用18b结核分支杆菌活菌制备豚鼠模型比应用灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠模型DTH反应更强烈，24 h DTH皮试反应红斑纵横径值为(18±3)mm，但会引起动物消瘦甚至死亡。根据我们的研究结果和已知文献[8,11]，我们发现豚鼠DTH皮试反应的强度与结核分支杆菌是否灭活有关，与致敏次数无关，多次致敏不能达到增加变态反应强度的效果。当致敏剂量达到可引起明显DTH皮试反应的情况下，增加致敏剂量对皮试结果无显著影响，反而可能会引起接种部位的严重溃烂。

人类感染结核杆菌后，会引起嗜睡、精神萎靡、体重减轻直至死亡等[9]，本研究应用灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，豚鼠体重持续增长，未观察到豚鼠有明显不适反应。注射部分出现溃烂主要是弗氏不完全佐剂引起的不良反应[10]，采用多点注射可以适当降低溃烂的发生率。

总之，本研究完善了结核病生物诊断试剂模型建立，改进了制备灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠模型的方法。与国内外文献记载的其他结核病生物诊断模型制备方法相比，本研究采用0.2 mg/mL H37Rv灭活全菌体单次致敏豚鼠，可引起适当的变态反应(达到标准要求)且不会引起动物死亡，是比较合适的致敏剂量，可广泛应用于结核病生物诊断试剂的研制和评价。

参考文献：

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[9] Kashino SS, Ovendale P, Izzo A, et al. Unique model of dormant infection for tuberculosis vaccine development [J]. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13:1014-1021.

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[11] 张灵霞, 吴雪琼, 史迎昌, 等. 几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究[J]. 中国防痨杂志， 2002, 24:116-118.