荧光定量RCR检测比格犬雌激素β受体mRNA在间情期与发情期表达量的差异

钟 睿，甘 艺，任秀梅，许 琴，赵彦斌，刘 冰，孙兆增，朱宇旌，栾新红，胡仲明，张 勇，曾 林

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866；2.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071；3.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319)

比格犬广泛的应用于各种医学科研, 是国内外公认的实验犬[1]。本实验室对比格犬的生殖生理进行了一定的基础研究[2]。但近期其种群中出现了不发情、休情期延长等情况，影响了这一种群的繁衍，也影响了实验动物的生产供应。动物发情主要受下丘脑、垂体以及激素调控，而雌激素又在调节过程中起着重要作用，因此研究雌激素在发情周期中的变化情况就显得举足轻重了。发情周期分为发情前期、发情期、发情后期和间情期，然而本实验组旨在探究ERβ基因在发情周期中的变化情况，并不是要细化各个发情周期，因此将发情周期简化为发情期和间情期，这样也便于对基因进行定量。

雌激素像其他激素一样能够诱导很多生理反应，这些作为调解功能的受体从1960年开始就一直受到关注。1986年雌激素受体被克隆出来[1]，并在小鼠的很多器官系统中发现了其预期中的显型[2]，一时间得出的结论是仅有这一种雌激素存在。然而1996年，Jan-Ake Gustafsson[3]在重要的学术报告会上宣称他的团队已经发现了雌激素的第二种形式，从而最先克隆出来的受体被命名为ERα，第二种受体被命名为ERβ，ERβ基因是在应用大鼠前列腺cDNA和PCR退火引物探索雄激素受体额外作用的过程中发现的。一直以来，都有人不断的研究ERβmRNA在组织中的表达量，但对比格犬的研究相对较少，因此本实验应用实时荧光定量PCR技术(QRT-PCR)探究ERβmRNA在间情期和发情期比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内的表达情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物

比格犬12只，发情期比格犬和间情期比格犬各6只，军事医学科学院实验动物中心提供【SCXK(军)2002-001】。

1.2 仪器和材料

pEGFP-N1-ERβ重组质粒，由本实验组构建，TRIZOL购自Invitrogen公司，DEPC购自Promega公司，反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)和SYBR® Premix Ex TaqTMII购自TaKaRa公司，Real Time PCR扩增仪(BIO-RAD iQTM5)。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取及RT-PCR

参照Trizol试剂盒方法[4]提取比格犬下丘脑、垂体、卵巢和子宫中的RNA，依据反转录试剂盒说明书进行反转录，反应体系为：5×PrimeScript Buffer 4 uL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 uL，Oligo dT Primer 1 uL，Random 6 mers 1 uL，Total RNA 5uL，RNase Free H2O加至20 uL。反应条件为：37℃ 30 min；85℃ 5 s；4℃保存。

1.3.2 合成引物

根据GenBank 中比格犬的ERβ(XM_861041.2)和β-actin(AF021873)基因序列，利用primer premier 5.0软件进行引物设计，ERβ基因上下游引物序列分别为：5’-tctcccttagccatccattg-3‘和5’-gcatccctctttgaacttgg-3’, 扩增产物长度为179 bp；内参基因β-actin上下游引物序列分别为：5’-cctgtcttacccaatgttttcc-3‘和5’-gcagcactttattttcctcacac-3’，扩增产物长度为235 bp，引物送至上海生物工程有限公司合成。

1.3.3 QRT-PCR

制作标准曲线：以pEGFP-N1-ERβ为模板，按照十倍浓度梯度稀释6个浓度标准，按照预先筛选好的反应条件及反应体系进行扩增。扩增体系：SYBR®PremixExTaqTMII 12.5 uL，上游引物1 uL，下游引物1 uL，cDNA模板1 uL，灭菌蒸馏水加至25 uL。扩增条件：预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火58℃/63℃(β-actin/ ERβ)20 s，循环40次；熔解曲线为95℃ 1 min；55℃ 1 min；55℃循环133次(每隔0.3℃采集一次荧光信号)，到94.6℃,通过熔解曲线对荧光定量PCR产物进行特异性分析[5]。所有的样品都在反应孔中做3次重复。所得数据经iQ5自带的软件进行分析整理。

2 结果

2.1 QRT-PCR结果

标准曲线结果显示ERβ和内参基因β-actin相关系数R2均大于0.98，说明结果具有可信度；扩增效率分别为98.4%和100%，都在80%～120%之间，而且非常接近1，扩增效率理想。内参基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的标准曲线如图1所示：

此外，R2(β-actin)-R2(ERβ)< 0.1，所以可以通过2- ΔΔCT方法对目的基因进行相对定量。扩增曲线与熔解曲线表明目的基因及内参基因没有产生非特异性扩增及引物二聚体，可作分析使用。内参基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的扩增曲线如图2所示：

内参基因β-actin(A)和ERβ基因(B)的熔解曲线如图3所示：

2.2 比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑中ERβmRNA的相对定量结果

运用2-△△CT法进行定量，即△CT目的基因=CT目的基因-CT内参基因，△△CT=△CT间情期ERβ基因-△CT发情期ERβ基因[6]，ERβmRNA表达差别以2-△△CT表示。间情期的比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内ERβ基因mRNA的表达量是发情期的比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内ERβ基因mRNA的表达量的0.35倍、0.17倍、0.44倍、0.43倍，如图4所示：

图1 ERβ和β-actin基因的标准曲线

图2 β-actin和ERβ基因的扩增曲线

注：A：卵巢内ERβmRNA的定量结果；B：子宫内ERβmRNA的定量结果；C：垂体内ERβmRNA的定量结果；D：下丘脑内ERβmRNA的定量结果。

图5 雌激素调控发情的机制

3 讨论

犬类是一次发情的物种，随着一段单一发情阶段会有几个月性活动不活跃。这些繁殖周期根据下丘脑-垂体-卵巢轴受着内分泌调控。可是，调控雌犬循环往复的发情的确切机制还不清楚。现如今，另一种ER子类型，ERβ，从大鼠前列腺被克隆出来；ERβ蛋白对雌激素有着高亲和性。但是，没有针对犬类组织中cDNA序列和ERβ的表达的相关资料。ERβmRNA主要分布在大鼠粒层细胞内，说明ERβ可能对粒层细胞增殖起着重要作用。现如今的研究表明ERβmRNA水平较之间情期早期在间情期末期有着显著的提高；此外，ERβmRNA水平与血浆中E2水平呈正相关，这可能暗示犬卵巢内的ERβ是与卵泡生长和卵巢反应力相联系的[7]。雌激素调控发情的机制如图5所示：

如图所示，ERβ既在细胞质内起作用，又在细胞核内起作用，发情期起始雌二醇进入细胞质内与ERβ结合形成E2-ERβ复合体，E2-ERβ复合体又与效应器蛋白相结合，引起信号级联，随后激活细胞质内激酶，之后会引起细胞核内E2-ERβ复合体与辅表达蛋白结合在雌激素反应元件上起作用，还会直接作用于转录因子，再在反应元件上起作用，也会使结合着辅表达蛋白的E2-ERβ复合体与转录因子结合，然后在反应元件上起作用，以这种方式复制的mRNA翻译成的蛋白质会引起细胞内一系列反应，反应的结果使得在发情期ERβ的含量较间情期增多，也就是本实验的荧光定量所显示的结果。

参考文献：

[1] 孙兆增，曾林，洪宝庆，等．乙烯雌酚对间情期比格犬发情的诱导[J]．中国比较医学杂志，2008，18( 11) : 36 -43．

[2] 孔德强，李爱学，曾林，等．一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析[J]． 中国比较医学杂志，2011，21(7) : 44 -47.

[3] Greene GL, Gilna P, Waterfield M,etal. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA[J]. Science, 1986, 231: 1150-1154.

[4] Lubahn DB, Moyer JS, Golding TS,etal. Alteration of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the mouse estrogen receptor gene[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1993, 90: 11162-11166.

[5] Kuiper DDJM, Enmark E, Pelto-Huikko M,etal. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93: 5925-5930.

[6] 赵彦斌，孙兆增，曾林，等．黑线仓鼠及其白化突变系 TYR、TYRP1的基因表达水平比较分析[J]. 中国比较医学杂志，2012，22(7)：1-4.

[7] Shingo H, Ryuzo T, Daijiro K,etal. Expression of estrogen receptor α and β genes in the mediobasal[J]. Neuroscience Letters, 2003, 347: 131-135.