比格犬雌激素受体β四个剪接异构体的发现

许 琴，董 翔，李建瑛，许永华，任秀梅，赵彦斌，白杰英，孙兆增，曾 林，胡仲明

(1. 军事医学科学院实验动物中心，北京 100071； 2. 兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科，乌鲁木齐 830000)

作为标准实验动物，比格犬在医药、公共卫生、生命科学以及军事医学研究领域得到了广泛的应用。但随着实验动物化时间的延长以及长期的封闭群繁殖饲养，我国比格犬种群中出现了不同程度的繁殖障碍。为解决上述生产中遇到的问题，对比格犬生殖生理进行研究很有必要。雌激素通过其受体在下丘脑-垂体-卵巢轴对雌性动物的生殖机能进行着周期性的调控。雌激素受体有三种亚型α、β、γ(Estrogen receptor α, β, γ， ERα， ERβ， ERγ)，其中ERγ仅存在于鱼类[1]。有研究表明在不同生殖周期中，ERα、ERβ的表达水平，表达时间及组织表达部位不同[2]，并且ERα敲除小鼠雌性不育，雄性繁殖力严重下降，ERβ敲除小鼠雌性与雄性能够繁殖，但产仔率降低，窝产仔数明显减少，并且已有研究表明ERβ是一种雌激素依赖性肿瘤的抑制因子[3-5]，为了解ERβ在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴发挥的调控作用，研究团队自2011年以来，对比格犬生殖内分泌轴上ERβ的剪接异构体存在情况进行了筛查[6-7]，发现了ERβ的四个剪接异构体，现总结报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

PCR扩增仪(PTC-2000，BIO-RAD)，高速冷冻离心机(3-18K，SIGMA)，-80℃超低温冰箱(NU-9483E，NUAIRE)，微量分光光度计(NanaDrop 2000，Thermo)，核酸电泳仪(ESP1001， amersham pharmacia biotech)，紫外凝胶成像仪(ACI，UVP)，180℃干烤手术器械一套，移液器一套(Eppendof)。

1.1.2 主要试剂

Trizol购自 Invitrogen 公司，DEPC购自 Promega 公司，ReverTra-Ace反转录试剂盒购自TOYOBO公司，pMD18-T Vector, LA Taq酶，dNTPmix，2×GC buffer购自大连宝生物公司TaKaRa产品，标准分子量核酸DNA Marker DL-2000 购自康为世纪公司，DNA片段凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒为博迈德公司BioFlux产品，其它试剂均由军事医学科学院条件处提供，为进口分装或国产分析纯试剂。

1.1.3 菌种及实验动物

大肠杆菌DH5α感受态细胞购自博迈德生物公司。

雌性比格犬11只(9只间情期犬，编号为1-9号；2只发情期犬，编号为F1，F2)，18～20 kg，由军事医学科学院实验动物中心提供【SCXK (军) 2012-001】，取材在军事医学科学院实验动物中心实验室内进行【SYXK(军)2012-005】。

1.2 实验方法

1.2.1 组织标本的获取

取材器械包高压灭菌后，180℃干烤8 h以上备用，组织冻存管0.1% DEPC水处理后高压灭菌备用。实验动物用速眠新Ⅱ注射液(1.5 mL/支)，按照0.08～0.1 mL /kg体重肌肉注射，待动物麻醉瘫软后，颈动脉放血处死动物，迅速留取下丘脑、垂体、子宫、卵巢组织标本，于冻存管中液氮冻存。

1.2.2 引物设计

根据NCBI网站公布的比格犬雌激素受体-β mRNA CDS区序列(犬ESR2 mRNA 24转录本，gene 1968 bp，CDS区1593 bp，Gene ID:403639)设计两对引物：真核ERβ-F：CCCAAGCTTATGGATATCAA AAACTCTCCATCTAGCC；真核ERβ-R：CGCGGA TCCTCACTGAGATGTGGTCTTCTGGGAGC，用于扩增全长序列。经限制性内切酶分析后，在犬ERβ一对引物的上游引入Hind Ⅲ，下游引入BamH Ⅰ内切酶位点，为构建真核表达重组子，在引物的下游均去除了终止密码子TGA。

筛查比格犬ERβ可能存在的两两外显子缺失的剪接异构体，设计引物如下：

1.2.3 下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织总RNA的提取

采用Trizol一步法提取比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫总RNA。微量分光光度计测定A260、A280的吸光度值，准确定量总RNA的浓度和纯度。取1 μg RNA用于1%琼脂糖电泳，以检测RNA的完整性。将RNA储存于-80℃冰箱备用。按照ReverTra Ace(TOYOBO)试剂盒操作说明书，将总RNA反转录为cDNA，反转录产物保存于-20℃冰箱中。

1.2.4 PCR扩增ERβ基因

ERβ基因扩增：模板为7丘(即7号犬下丘脑)cDNA，扩增体系25 μL如下：PCR 反应程序： 95℃预变性5 min；95℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸2 min；33个循环；最后延伸8 min。PCR产物进行1%琼脂糖电泳查看结果。

ERβ可能的两个外显子缺失筛查PCR反应：模板为ERβ全长PCR产物，引物为针对可能的外显子缺失所设计，反应体系同ERβ基因扩增体系。

引物名称引物序列(5、-3、)产物长度针对的外显子Exon 1-3FATGGATATCAAAAACTCTCCA1/2/两者Exon 1-3RGCATATGTAATCATTATG555 bp(1-555)Exon1-4FCCTGTAAACAGAGAGACACTG2/3/两者Exon1-4RGGTCACGTGGCCACCATT408 bp(352-759)Exon2-5FTGGTCGTGTGAAGGATGTAAGGCC3/4/两者Exon2-5RGAGCTCCACAAAGCCTGGAAT477 bp(490-966)Exon3-6FGTGAAGTGTGGCTCCCGGAGA4/5/两者Exon3-6RCCCCTCATCCCTGTCCAG459 bp(643-1101)Exon4-7FTTCACCGAGGCCTCCATG5/6/两者Exon4-7RCTTCCGGCTGCTCTCCGCCTCCTG411bp(865-1275)Exon 5-8FGACCACCCGGGCAAGCTCATC6/7/两者Exon 5-8RCAGCAGCAGGTCGTAGACTGGGAC432 bp(1045-1476)Exon6-8FTGCGTAGAAGGAATTCTGGAA7/8/两者Exon6-8RCCCGCGGAGTGTGTGCGC402 bp(1105-1506)Exon7-8FAAGGCCATGGTCCTCCTCAACTCC7/8/两者Exon7-8RTCACTGAGATGTGGTCTTCTG393 bp(1201-1593)

PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s；33个循环；最后延伸8 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳查看结果。

1.2.5 PCR扩增产物的纯化

PCR扩增产物的纯化按照康为世纪公司DNA胶回收试剂盒回收相应目的片段，按照试剂盒说明书进行。纯化后的PCR产物与pMD-18T载体连接，16℃连接过夜。连接产物参照博迈德公司DH5α感受态细胞操作步骤进行转化。菌液PCR鉴定阳性克隆。初步鉴定为阳性的菌液，提取质粒送北京中科西林测序部测序鉴定。

2 实验结果

2.1 比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织总RNA的提取

比格犬下丘脑，垂体，卵巢，子宫组织总RNA提取(图1)，ERβ的扩增及菌液鉴定(图2)。

注：①F2犬下丘脑，垂体，卵巢，子宫，M: DL2000 DNA 标准分子量；② 3号犬卵巢与子宫，M: DL10000 DNA 分子量标准；③7号犬垂体与下丘脑。

注：①7号犬下丘脑，垂体；② F2犬子宫，卵巢，下丘脑，垂体；③PCR扩增产物菌液鉴定7号犬垂体与下丘脑；①②③中M均为DL2000 DNA 分子量标准。

比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织总RNA的浓度测定结果见表1。

表1 下丘脑、垂体、卵巢、子宫总RNA浓度

由图1及表1中结果可见，提取的组织总RNA 1%琼脂糖电泳中28s和18s两条核糖体RNA条带清晰可见，比较完整，浓度测量纯度较高，满足后续基因扩增的要求。经过预实验确定，以F2丘(F2犬下丘脑cDNA)为模板扩增ERβ mRNA，以F2垂(F2发情期犬垂体)、7丘(7号犬下丘脑)cDNA为模板进行ERβ可能存在的两个外显子缺失剪接异构体的筛查。

2.2 ERβ基因测序结果

以7号犬下丘脑，垂体，2号发情犬(F2)下丘脑、垂体为模板进行扩大体积扩增，均在1000 bp～2000 bp之间有两条带，经比对两条带都是比格犬ERβ 24转录本 mRNA序列，产物长度分别为1593 bp、1293 bp(比对结果此文未列出)。分析ERβ1593与ERβ1293的mRNA序列，后者在ERβ1593第一外显子 ATG起始密码子之前增加63 bp碱基，为载体序列，并且在第656-955位缺失300 bp，所缺失部分恰好是ERβ1593的第四外显子的完整部分，推测是ERβ1593的一个剪接异构体。

2.3 ERβ可能的两两外显子缺失筛查结果

2.3.1 引物筛查及可能的外显子缺失异构体片段的筛查

所有引物以相同的模板，根据引物的Tm值，设计温度梯度进行温度梯度PCR，根据扩增产物对引物进行筛查(图3)。

由扩增电泳图可知，Exon1-4在48℃～58℃，Exon2-5在51℃～61℃，Exon4-7在52℃～64℃的温度梯度内的扩增产物均为单一条带，或主带之外有非常弱的非特异扩增带(如1-4)，但不能后用于后续的回收纯化连接及转化，所以不能用于后续的可能的外显子缺失型的剪切异构体的筛查，Exon1-3，Exon3-6，Exon5-8，Exon6-8可用于后续的筛查。用后面的这四对引物，由其最适扩增条件进行新一轮扩增(图4-①)。

注：①引物1-3，1-4温度梯度筛查：1～5由引物Exon1-3扩增，6～10由引物Exon1-4扩增；②引物2-5，3-6，4-7温度梯度筛查：1～5由引物Exon2-5扩增，6～10由引物Exon3-6扩增，11～15由引物Exon4-7扩增；③引物5-8，6-8温度梯度筛查：1～5由引物Exon5-8扩增，6～10由引物6-8扩增。M. DM2000 DNA 标准分子质量。

注：1-3，3-6，5-8，6-8为引物代码，M. DM2000 DNA 标准分子质量。

Exon1-3扩增产物主带为555 bp，与预期结果一致，主带之上、之下各有一条可回收的非特异带：1-3上、1-3下；Exon3-6扩增产物主带为459 bp，与预期结果一致，主带之下有一条可回收的非特异带：3-6下；Exon5-8扩增产物主带为432 bp，与预期结果一致，主带之下有一条明显的非特异带：5-8下；Exon6-8扩增产物主带为402 bp，与预期结果一致，主带之下也有一条明显的非特异带：6-8下。将所扩增出的条带进行回收纯化(见图4-②)，并测序比对鉴定。

2.3.2 ERβ外显子缺失异构体片段的测序比对

由四对引物回收纯化后的产物，测序后在NCBI网站上进行比对，均为比格犬ERβmRNA 部分CDS序列，经DNDMAN软件比对和手动校对后，获得了比格犬ERβ的4个剪接异构体的部分序列。

Exon3-6引物所辖定的主带序列与3-6下产物125 bp运用DNNMAN软件比对后，有部分错码，经手动校对，结果发现部分第4外显子与部分第5外显子缺失，缺失334 bp，缺失段为第4外显子289 bp(阴影标示)和第5外显子45 bp(下划线标示)，是比格犬ERβ的一种剪接异构体形式，比对结果见图5，图6。

图5 部分第4与部分第5外显子缺失的DNAMAN比对

图6 部分第4与部分第5外显子缺失的手动比对

Exon3-6主带与3-6下194 bp产物运用DNAMAN软件比对后有部分乱码，经手动校对发现265 bp缺失，缺失段为部分第四外显子(163 bp，阴影标示部分)与部分第五外显子(102 bp，下划线标示部分)。结果发现是另一种部分第4与部分第5外显子组合缺失型的比格犬ERβ剪接异构体形式，比对结果见图7，图8。

图7 部分第4与部分第5外显子缺失的DNAMAN比对

图8 部分第4与部分第5外显子缺失的手动比对

Exon3-6主带与3-6下159 bp产物运用DNAMAN软件比对后也出现部分乱码，经手动校对发现300 bp缺失，缺失段为完整的第4外显子序列，结合ERβ主基因的扩增，及ERβ1293的出现可判定ERβ第四外显子缺失是比格犬ERβ基因的又一种剪接异构体形式，图9，图10。

图9 第四外显子完整缺失DNAMAN软件比对

图10 第四外显子完整缺失的手动比对

图11 第七外显子完整缺失的DNAMAN软件比对

Exon5-8主带(432 bp)与5-8下回收产物(251 bp)运用DNAMAN比对时也出现部分序列乱码，经手工校对后发现了比格犬ERβ的第4种剪接异构体，选择性剪接发生在第7外显子上，缺失181 bp，是第7外显子编码序列的完整缺失，比对结果见图11，图12。

图12 第七外显子完整缺失的手动比对

图13 第7外显子完整缺失(引物Exon6-8)

Exon6-8主与6-8下比对也发现了第七外显子(181 bp)的完整缺失，是ERβ基因的第七外显子完整缺失型剪切异构体，比对结果见图13。经5`，3`RACE获得了比格犬ERβ第七外显子缺失剪切异构体的全长编码序列ERβ1257，因第七外显子的缺失使主基因发生了移码突变，翻译提前终止(测序结果此文未列出)。

结合DNAMAN软件比对及手动校对结果，应用所涉及的两两筛查引物，本实验共筛查出了比格犬ERβ的四个剪接异构体，分别为：第4外显子完整缺失型剪接体；第4外显子缺失289 bp与第5外显子缺失45 bp(总计缺失334 bp)的组合缺失型剪接体Ⅰ；第4外显子缺失163 bp与第5外显子缺失102 bp(总计缺失265 bp)的组合缺失型剪接体Ⅱ；第7外显子完整缺失型剪接体。对第4外显子完整缺失及第7外显子完整缺失的剪接异构体，研究小组通过5、-3、RACE获得了全长序列，并构建了真核表达重组子，对其表达及功能进行了系列的研究[8-9]，而对于第4与第5外显子部分缺失的两种组合型缺失剪接异构体，本研究仅发现了部分编码序列，并非全长CDS序列。

3 讨论

比格犬ERβ位于8号染色体上(XM_861041.2，gene ID:403639)，全长1968 bp，CDS区1593 bp，编码530个氨基酸(aa)[10]。本实验在扩增比格犬ERβ全长序列时在主带之下有一条明显条带，将两条带均回收纯化克隆，得到两个产物，一为ERβ1593，另一为ERβ1293，前者是比格犬野生型的ERβ，后者是比格犬ERβ的一种剪接异构体，其第四外显子完整缺失。

针对ERβ的每一个外显子，两两顺次组合设计引物(每对引物包含两个完整的外显子)，进行扩增，对只能扩增出单一条带的引物进行剔除，而对除目的条带外，还能扩增出比较明显的可以回收的非特异条带(也可能是ERβ的一种剪接异构体)的引物，进行扩大体积扩增并回收纯化克隆产物，测序后在NCBI网站比对，结果确定是目的基因的，再与主带进行比对分析，如此我们得到了第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失300 bp)，部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体(各缺失334 bp，265 bp)，以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失181 bp)，根据实验分析，及其它种属的相关文献报道[11-16]，比格犬ERβ还存在其它形式的剪接异构体，但因在不同的生理条件或者病理条件、不同的发育时期、不同的组织或不同的细胞内，其表达时期及表达水平不同，所以对这些情况还需进行扩大碱基序列再次排查，该项工作课题组其它研究成员正在进行。

本研究中扩增出的比格犬ERβ mRNA CDS区第七外显子(181 bp)完整缺失，导致ERβ阅读框移位，使其在终止密码子之前引入了10个非ERβ编码的氨基酸残基。该发现与Fitzgerald SD在ERα上的发现相似[17]。García Pedrero等[18]在多种正常组织和肿瘤中分离出了ERα的一种剪切异构体ER△E7，ER△E7第七外显子完整缺失，失去了与p160辅激活因子(如SRC-1，AIB1)的雌激素依赖性的相互作用，ER△E7能以激素依赖的形式与 ERα 和ERβ 形成异源二聚体。本研究发现第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体，所缺失的相应氨基酸编码序列为409-469aa，是野生型ERβ配体结合区298-469aa中的部分序列，部分配体结合序列的缺失，是否引起该剪接异构体配体结合能力及信号转导途径的改变，以及缺失序列之后掺入的十个氨基酸残基与野生型ERβ的配体结合区是否具有同源性等，对此还需进一步进行实验验证。

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