长爪沙鼠不同willis血管类型全基因组文库构建

张 贺，陈振文，王承利，孙 倩，陆 娜，王 洋

(1. 沈阳军区总医院实验动物科，沈阳 110015；2. 首都医科大学实验动物部，北京 100669)

脑卒中，又称脑血管意外(cerebrovascular accident，CVA)，俗称“中风”，是由向大脑供血的动脉血管缺血引起的一种急性疾病[1]。脑卒中给人类健康和生命造成极大威胁，给患者带来极大痛苦，家庭及社会负担沉重[2]。因此，为提高预防与治疗水平，研究脑卒中的发病机制，找到合适的脑动脉缺血动物模型成为当务之急[3]。

长爪沙鼠(Merionesunguiculatus，Mongolian Gerbil)是一种具有独特生物学特性实验动物资源[5-6]，其脑底动脉环(Willis circle)前后交通支血管缺失的遗传特征，成为研究人类脑缺血的天然动物模型[7-8]，通过简单的结扎方法即可获得比大鼠、小鼠更加典型的人类脑缺血动物模型[9-11]。为了进一步研究不同Willis环与基因表达差异的关系，建立包含全部Willis血管类型的全基因组文库，为后续研究打下坚实基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年长爪沙鼠96只，雌雄各半，体重50～70 g之间，清洁级，由首都医科大学实验动物学部提供【SCXK(京)2010-0020】。实验在沈阳军区总医院进行【SYXK(军)2012-002】,并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 实验器材及主要试剂

手术器械，多功能实验动物解剖台 莱尔(北京)净化设备有限公司； Library Production Kit和pCC1FOS Vector 均由EPICENTRE Biotechnologies公司提供；基因组DNA小量制备试剂盒由AxyPrep公司提供。

1.3 Copy Control Fosmid文库的构建

1.3.1 基因组DNA的提取

安乐死术处死动物后，快速剪下头部，剪去颅骨，小心剥离脑组织，用生理盐水洗去血污，置于解剖台下观察脑底动脉环前交通支(anterior communication arteries, ACA)和后交通支(posterior communication arteries, PCoA)的类型，剥离脑组织与血管，用苯酚氯仿法[12]从不同willis血管类型的组织中提取DNA，混合后将其溶解在TE溶液中，浓度为0.5 μg/ μL。

1.3.2 基因组DNA的剪切

取DNA溶液，至少包含2.5 μgDNA。用200 μL枪头反复吹吸DNA 100次，使基因组DNA充分剪切。

1.3.3 基因组 DNA的末端修复

反应体系：无菌水，2 μL；10×Buffer，8 μL；dNTP Mix，8 μL；ATP，8 μL；DNA，50 μL；End-repair enzyme Mix，4 μL；一共80 μL。

室温下放置培养45 min，然后加入TE缓冲液，70℃培养10 min，使End-repair enzyme Mix失活。通过末端修复，可以得到平末端、5’-磷酸化的DNA。

1.3.4 连接反应

反应体系：无菌水，1 μL；Fast-Link 10×ligation Buffer，1 μL；PCC2Fos Cloning-ready Vector，1 μL；ATP，1 μL；DNA，5 μL；Fast-Link DNA Ligase，1 μL；一共10 μL

室温培养2 h，然后将反应体系转移到70℃培养10 min，使Fast-Link DNA Ligase失活。

1.3.5 Copy Control Fosmid 克隆的包装

在包装反应前，将过夜培养的宿主菌EPI300-TIR Plating Strain接种到含有10 mmol/L MgSO4的50 mL的LB培养液中，37℃摇床培养。10 μL连接反应加入25 μL已经融化的packaging Extracts中；用移液器混匀，30℃包装90 min，加入剩余的25 μL packaging Extracts至管中，30℃下包装90 min。

1.3.6 Copy Control Fosmid文库的涂布和筛选

按照每100 μLEPI300-TIR宿主菌溶液中加入10 μL稀释后噬菌体微粒的比例将两者混合；37℃噬菌体吸附20 min；将感染了噬菌体的细菌涂布到含有12.5 mg/mL的LB平板上，37℃过夜培养，挑选Copy Control Fosmid克隆。

1.4 基因组DNA文库的鉴定

1.4.1 总克隆数CFU的鉴定：

取包装产物10 uL感染细菌(EPI300-TIR)100 μL后，涂布LB平板(含氯霉素)，第二天计数。

总克隆数CFU=平板上的克隆数/0.01 mL×N mL

1.4.2 平均插入片段及重组率的鉴定：

随机挑取15个克隆分别接LB液体培养基(含氯霉素)，摇菌后抽质粒，并与阳性对照质粒(约36 kb)同时跑电泳后(1%Agarose; 1.3V/cm；约12～16 h)，鉴定插入片段大小和重组率。

2 结果

2.1 不同willis血管类型

通过解剖，发现不同类型的willis环缺失(图1和图2)。

注：A：左前交通支；B：右前交通支；C：后交通支。

如图所示，根据willis环不同程度、不同位置的缺失，共可分为前交完整，后交完整(TO4组)，前交右缺，后交完整(NO2组)，前交右缺,后交缺失(NP1组)，前交左缺，后交缺失(TO3组)，前交完整，后交缺失(CJ1组)，前交左缺，后交完整(NK组)。

2.2 基因组DNA鉴定

以36 k标准质粒为对照组，对剪切后各组样品基因组DNA进行鉴定(图3)。

2.3 总克隆数CFU的鉴定

注：A：左前交通支；B：右前交通支；C：后交通支。1：TO4组 前交完整，后交完整；2：NO2组 前交右缺，后交完整；3：NP1组 前交右缺，后交缺失；4：TO3组 前交左缺，后交缺失；5：CJ1组 前交完整，后交缺失；6：NK组 前交左缺，后交完整。

库容鉴定瓶皿上平均克隆数为17个，平板上的CFU/ml=17/0.01 mL。总克隆CFU=平板上的CFU/mL× mL=1700×1=1700(图4)。

注：1：36K对照；2：NO2组；3：CJ1组；4：NK组；5：TO4组；6：TO3组。

图4 总克隆数CFU的鉴定图

2.4 鉴定平均插入片段及重组率

以36K标准质粒为对照，进行电泳。平均插入片段>30 kb，约36 kb左右。随机挑选15个克隆株，其中14个含有重组片段，重组率约93%(图5)。

3 讨论

3.1 长爪沙鼠willis circle的特点

长爪沙鼠是我国特有的一种小型草原动物，易于获得，大小适宜，具有独特的脑血管遗传特征，是一种很好的人类脑缺血疾病模型动物。[1, 13-14]与大小鼠等啮齿类动物脑底动脉分布不同，长爪沙鼠小脑上动脉与大脑后动脉之间缺少明显的后交通动脉，不能构成完整的Willis环，并有1/3以上缺失前交通动脉或前交通动脉一个组成根很细，利用此解剖学特征，结扎动物的一侧颈动脉，可导致该侧大脑半球缺血，从而获得典型的人类脑缺血动物模型，其依据即为联系大脑两个半球的脑底动脉前交通支和沟通基底动脉和大脑后动脉的后交通支均存在着不同程度的缺失，结扎单侧或双侧颈总动脉均能造成不同程度的脑缺血，而不像用其他动物制备该模型时必须同时切断颈总和基底动脉两个系统的供血途径，才能制备出有效的脑缺血模型[15]。用单侧结扎的方法更有诸多好处，首先是可以进行同体对照，即同一个脑的两个半球(一侧缺血，另一侧不缺血)进行组织学比较，比使用不同个体做对照更准确和方便；其次，移开动脉夹就可以逆转脑缺血或进行再灌注，即使不用进行再灌注动物也可以存活较长的时间，从而使这种模型与人实际发生的脑缺血更吻合，有利于治疗试验和药物评价试验的进行[16]。而它的缺点在于长爪沙鼠的前后交通支缺失的类型较多，从理论上来说，只有前后交通支同时缺损才能用单侧结扎的方法制备模型。

3.2 基因组DNA 文库的特点

所谓基因组 DNA 文库是指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，具有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。

注：1和17：36 kb对照质粒，2-16：随机挑选的克隆株。

基因组DNA文库具有代表性和随机性双重特点。其代表性是指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。其随机性是指文库构建过程中采用物理或化学方法随机切割基因组DNA，保证克隆的随机性，使每段DNA在文库中出现的频率均等。

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