淫羊藿苷对受损斑马鱼胚胎血管发生的促进作用

李 菲, 黄晓慧, 龚其海, 李铭源, 董红心,3, 石京山

(1.遵义医学院 药理学教研室暨基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义 563099；2.澳门大学 中国医学科学研究院， 澳门 000853；3.美国西北大学 精神病学与行为科学实验室，美国 芝加哥 60611)

淫羊藿又名仙灵脾，为小檗科(Berberidaceae)淫羊属(EpimediumL)植物。据《中国药典》记录，淫羊藿具有很高的药用价值，性味辛、甘、温，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效[1]。淫羊藿主要有效成分之一，淫羊藿苷(icariin, ICA)属于黄酮类化合物，药理作用广泛包括抗肿瘤，促进骨形成，以及保护神经元等[2]。ICA在血管系统的突出作用一直备受关注，表现为抗动脉粥样硬化、改善血液流变学等[3]。近来文献报道，ICA在体外可促进人外周血内皮祖细胞增殖[4]。然而ICA在整体环境下是否可促血管生成尚不清楚，本实验采用转基因斑马鱼血管受损模型，研究ICA对血管发生的影响。

1 材料

荧光显微镜(Leica荧光显微镜，德国Leica公司)；淫羊藿苷(南京泽朗医药技术有限公司，经HPLC测定其纯度≥96%)；血管生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGFR Kinase Inhibitor‖, VRI, Clabiochem company/EMD chemicals Inc, cat. no.676481)；所用斑马鱼为Tg(fli-1:EGFP)转基因斑马鱼由澳门大学提供。

2 方法

2.1 斑马鱼的饲养 斑马鱼的饲养方法根据斑马鱼手册的描述而设定。在25 L的反渗水中饲养，水温控制在摄氏28℃，光照按14 h日光和10 h无光为周期，每天早上9:30开始光照，每日以丰年虾及热带鱼粮于早上及下午喂饲2次。

2.2 斑马鱼胚胎的收集 光照后1 h收集胚胎，继续培养在反渗水中，温度28.5℃。于受精后4h保留健康胚胎，挑出未受精及发育不健全的胚胎。

2.3 模型制备及药物处理 健康斑马鱼胚胎继续培养至21 h后拆蛋壳，分为6组(每组10～15条，重复2次)，空白对照组(Control)、模型对照组(VRI)、不同浓度ICA处理组(30，100，300 μM)。除空白对照组外，其余4组均给予工具药血管内皮生长因子受体抑制剂(VRI)500 ng·mL-1作用3 h，清洗掉含VRI的培养液[5]，更换为不同浓度的ICA培养液继续培养24 、48 h，用药结束后采用荧光显微镜观察。

3 结果

淫羊藿苷对VRI作用3 h所致斑马鱼胚胎体节间血管和肠下静脉受损的影响。VRI作用于斑马鱼胚胎3 h后，将培养液清洗并替换为含有不同浓度ICA的培养液继续培养24 、48 h。荧光显微镜下观察发现(见图1)：空白对照组胚胎于24 、48 h均可见完整的体节间血管，数量为28±1.9条，几乎无受损血管，血管绿色荧光清晰明亮。给予VRI作用3 h后的模型对照组胚胎内完整的体节间血管几乎全部缺失，24 h观察到残存的受损血管数量3.3±2.2条，而48 h后开始恢复，受损血管数量达9.3±2.2条。给予ICA后能明显增加完整的体节间血管数量，并随着药物剂量增加和作用时间延长完整的血管数量也增多。30 μM的ICA作用24 、48 h斑马鱼所有血管数量为7.4±2.4和10.9±4.0条；ICA在100 μM时作用24 、48 h后血管数量为17±2.7和22.3±5.2条；300 μM作用24、48 h后血管数量分别为23.2±3.1和25.6±2.7条。100和300 μM的ICA给药组斑马鱼体节间血管数量均比模型对照组多，具有统计学意义(P<0.05)。

n=10～15，重复2次。vs Control, *P<0.05；vs VRI, #P<0.05。VRI：血管内皮生长因子受体抑制剂；ICA：淫羊藿苷；ISVs：体节间血管；SIVs：肠下静脉；hrs：小时数；柱状图红色部分：完整的ISVs；蓝色部分：不完整的ISVs；纵坐标为血管条数。 图1 淫羊藿苷对VRI作用3 h所致斑马鱼胚胎体节间血管和肠下静脉受损的影响

ICA对斑马鱼胚胎肠下静脉的发生也具有促进作用的趋势，但不如对体节间血管的作用明显，本实验未对该作用进行量化分析。

4 讨论

淫羊藿苷结构清楚属8-异戊烯黄酮醇苷化合物，分子式C33H40O15，分子量676.67，我室研究发现ICA在体内代谢可诱导药物代谢Ⅱ相酶的表达[6]。大量体外实验表明，ICA对血管内皮细胞具有积极的促进作用，如提高eNOS活性增加NO的产生而保护血管内皮细胞[7]；刺激体外血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成[8]；促鸡胚尿囊膜模型和牛主动脉内皮细胞模型的血管生成[9]；激活内皮祖细胞MEK/ERK和PI3K/Akt/eNOS信号途径刺激血管生成[10]。本实验结果提示ICA可促进整体模型转基因斑马鱼的血管发生。

本实验采用的Tg(fli-1:EGFP)转基因斑马鱼是一种能在内皮细胞中表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的组织特异性转基因斑马鱼[11]，是理想的观察胚胎血管系统发育的可视性模型。Tg(fli-1:EGFP)系转基因斑马鱼能表达位于fli-1启动子上的EGFP序列[12]，而fli-1是一个在小鼠身上广泛使用的内皮细胞标记基因[13]，同时也在斑马鱼胚胎血管发育时会表达[14]。与活胚胎的微血管摄影技术相比较，转基因斑马鱼能在不同的时间点，不需要对斑马鱼血管进行任何固定的处理，就能实时地进行血管系统发育的观察。因此，在研究有关血管新生的药物效应上，Tg(fli-1:EGFP)转基因斑马鱼是一个非常有价值的整体模型。

血管内皮生长因子(VEGF)是血管形成过程中最具特异性的生长因子[15]，其作用的发挥在于与其受体(VEGF-R)结合后引发的一系列信号途径相关。本实验采用血管内皮生长因子受体抑制剂(VRI)与转基因斑马鱼胚胎共孵育3 h导致斑马鱼胚胎体节间血管和肠下静脉几乎全部缺失，进一步证实了VEGF-R在血管发生过程中的重要作用。采用不同浓度的ICA治疗后，受损的血管逐渐恢复，完整血管的数量随药物剂量的增加和药物作用时间的延长而增多。而对于ICA促血管发生的作用机制是在血管内皮生长因子受体层面，还是受体前，或受体后的信号调节，本实验未及探讨，故对其机制研究仍需继续深入。

总之，本实验结果证实ICA在整体情况下具有显著促血管发生的作用，以此研究为基础，有望研制开发一些具有临床应用价值的药物，为防治血管缺血性疾病提供一种新的策略。

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