马铃薯块茎特异性启动子克隆及其驱动的hIL12表达载体构建

杨加伟，李 伟，葛正龙

(遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

植物生物反应器具有操作简便、产物活性高、成本低、易扩大规模等优点，与微生物及动物细胞等其它生物反应器相比有独特的优势，因此在细胞因子、生长因子、抗体及疫苗等药用蛋白制造领域获得了广泛的研究和应用[1]。白细胞介素(IL)是一类体内含量极微的细胞因子，多为小分子糖蛋白，在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化，以及在炎症反应中均起着重要作用，目前已发现30多种。其中IL-12是由单核细胞、巨噬细胞分泌表达的一种细胞因子，具有多种生物学活性，在机体的抗肿瘤、抗病毒、抗过敏过程中均发挥着极其重要的作用，在临床上有着巨大的应用前景[2]。目前，虽已有商品化的重组IL-12出售，但价格极其昂贵，因此利用植物生物反应器高效表达生产IL-12，降低IL-12的生产成本，具有重大的应用价值。

本实验室前期研究中，构建了CaMV-35S启动子驱动的hIL12表达载体并导入马铃薯基因组，获得了表达hIL12的转基因马铃薯植株，体外实验表明重组hIL12具有生物学活性，但表达量较低[3-4]。利用植物自身的组织特异性强启动子替代CaMV-35S等组成型启动子来驱动外源基因的表达，是提高重组蛋白表达量的有效途径[5]。马铃薯PATATIN蛋白是一类分子量约为40 kD的糖蛋白，其在马铃薯块茎可溶性总蛋白中的含量高达40%，而在其它组织中的含量极少[6]。因此，本研究拟从马铃薯基因组中克隆驱动patatin基因高效表达的组织特异性启动子(Ppatatin)，并对克隆的启动子进行生物信息学分析，然后构建其驱动的植物表达载体，为其在马铃薯生物反应器中的应用和提高hIL12的表达量打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂 本研究用马铃薯材料中薯1号，由遵义市农科所提供。主要试剂有PCR反应液(Takara公司)、限制性内切核酸酶及DNA连接酶(Takara公司)、质粒提取试剂盒(TIANGEN公司)、琼脂糖(西班牙)等。克隆测序载体为pMD-18T，购买于Takara公司；双元表达载体pCAMBIA2301-MCS由中国热带农业科学院橡胶研究所赠送；大肠杆菌DH5α感受态细胞购于TIANGEN公司；质粒pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70由本实验室保存。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物序列(见表1)。

表1引物序列

引物名称引物序列 酶切位点Ppatatin-fCCGGAAGCTTTGCGTATTAGTTTTAGCGACGAHind IIIPpatatin-rCCCCGTCGACGTTGGTGCTTTGAGCATATAACSal IhIL12-fCAACGTCGACGGGGCAAGATGTGTCACCAGCAGSal IhIL12-rCCGGGAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAGCSac I

1.2 DNA提取 使用改良的CTAB法提取基因组DNA，取马铃薯块茎0.5 g于液氮中研磨粉碎，转入离心管，加入5 mL CTAB提取液，65 ℃加热30 min后，12 000 rpm离心10min。取上清，加入等体积的酚/氯仿抽提2次，取上清并加入等体积的异丙醇常温沉淀5 min，12 000 rpm离心5 min，弃上清，沉淀中加入5 mL 70%乙醇洗涤沉淀2次，最后完全弃除液体风干，加入100 μL TE/RNase缓冲液，-70 ℃保存。

1.3 PCR扩增 以基因组DNA或质粒为模板，利用表1的引物进行扩增。反应体系如下：模板50 ng、10×buffer 5 μL、dNTPs(10 mmol L-1)1 μL、引物(10 μmol L-1)各1 μL、Taq酶1 U、补水至50 μL。反应程序为：预变性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃充分延伸10 min。扩增循环数为26～30次。

1.4 启动子序列分析 序列同源性分析比对在NCBI网站BLAST页面(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行，启动子核心区序列及相关调控元件分析利用数据库Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)以及植物顺式调控元件数据库PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/ signalscan.html)和PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare.html)完成。

1.5 表达载体构建 利用引物Ppatatin-f和Ppatatin-r从基因组DNA中扩增Ppatatin启动子序列，琼脂糖凝胶电泳检测后割胶回收并连接T载体，送予上海生工公司进行序列测定。利用引物IL12-f和IL12-r从本实验室保存的pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70载体中扩增出hIL12基因序列并回收。接着，以Ppatatin-f+hIL12-r为引物，以回收的Ppatatin启动子片段和hIL12基因片段为模板，利用重叠PCR技术，扩增获得Ppatatin启动子+hIL12基因片段。用Hind III和SacI限制性内切酶酶切目的片段和表达载体pCAMBIA2301-MCS。回收相应片段后T4 DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌DH5α，重组质粒转化方法参见文献[7]。挑取转化子进行培养、酶切鉴定阳性克隆后，送予上海生工公司进行序列测定以确保序列正确，重组载体示意图(见图1)。

图1 表达载体示意图

2 结果

2.1 马铃薯基因组DNA提取和启动子Ppatatin的获得 利用CTAB法，顺利提取了马铃薯基因组DNA(见图2A)。为获得最佳的PCR扩增效率，本研究对引物退火温度进行了摸索并设计了退火温度梯度，分别为55 、56、58、59 °C。结果显示，退火温度为55～56 °C时扩增效果最好，获得了约1000 bp大小的Ppatatin条带，且条带整齐、亮度集中(见图2B)。故以此为退火温度进行大量扩增后回收片段，通过T-A克隆技术，将目的片段导入pMD-18T载体，酶切鉴定(图2C)正确后进行测序分析。

A：马铃薯基因组DNA电泳图，1：λDNA标准品(100 ng)；2：马铃薯基因组DNA；B：不同退火温度下Ppatatin扩增效果；1～4分别是退火为55、56、58、59 °C时的PCR扩增条带，箭头所示为目标条带，下同；C：pMD-18T- Ppatatin重组质粒Hind III+ Sal I双酶切检测电泳图，1～4为不同单克隆。图2 Ppatatin扩增与T-A克隆鉴定电泳图

2.2 启动子Ppatatin序列鉴定和元件分析 通过DNA 测序表明所克隆的Ppatatin启动子序列大小为1019 bp，序列GC含量较低，仅为31.89%。搜索Genebank数据库中的同源序列，表明本研究克隆的序列与GeneBank中已公布的同源序列的一致性为98%以上。采用Neural Network Promoter Prediction 启动子数据库进行功能预测，结果表明克隆到的Ppatatin序列存在2处核心启动子区域(见表2)，并且得分较高(总分为1分)，表明该序列具有启动子功能。

表2 Ppatatin序列的核心启动子区

利用PLACE 及PlantCare 数据库进行在线预测，分析启动子的功能元件和重要调控区，结果显示(见图3)：在-52至-45 bp、-211至-205 bp以及-218至-213 bp处有3个TATA-box，其功能是保证转录得以精确起始；在-240至-235 bp及-405至-401 bp处有2个CAAT-box，决定着启动子的起始频率和强度。除了含有TATA-box和CAAT-box2个典型的启动子元件外，该序列还有多个与糖响应相关元件，包括：2个SURE1和2个SURE2蔗糖效应元件，分别位于-193至-184 bp、-513至-504 bp以及-206至-196 bp、-526至-516 bp处，这4个元件是马铃薯块茎中patatin基因启动子的保守调控序列；另有2个CGACGOSAMY3糖相关元件，位于-12至-8 bp和-1003至-999 bp处。有2个茎部特异表达相关元件：NODCON1GM 和NODCON2GM，分别位于-668至-663 bp和-788至-784 bp处。还有4个与储藏蛋白表达相关的EBOXBNNAPA顺式元件，分别位于-951至-946 bp、-452至-447 bp、-419至-414 bp和-160至-155 bp处；以及2个储藏物特异调控蛋白结合位点B-box，分别位于-604至-594 bp和-246至-236 bp处。此外，该序列中还发现了与调节植物生长发育相关的一些应激元件，例如：光反应元件ATCT-motif(-865至-856 bp)、AAAC-motif(-335至-324 bp)和G-box(-60至-55 bp)；与逆境相关的ABA应答元件ABRELATERD1(-770至-766 bp)等。以上分析结果表明该片段不仅具有完整的启动子表达调控元件，还具有与组织特异性相关的特异序列，而这些序列也正是驱动马铃薯patatin基因特异性表达所必须的。

图3 Ppatatin序列分析

2.3 表达载体的构建 本研究首先以pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70载体质粒为模板，通过PCR扩增获得了大小约为1.6 kb的hIL12基因片段(见图4A，泳道2)。接着，利用重叠PCR技术，将Ppatatin片段和hIL12基因片段合成在一起，获得了约2.6 kb的Ppatatin+hIL12基因片段(见图4A，泳道3)。接着，通过双酶切将母本载体pCambia2301-MCS上的CaMV-35S启动子切下，结果显示获得了大小约为12 kb载体片段和600 bp的CaMV-35S片段(图4B)，回收载体片段。通过体外连接，将Ppatatin+hIL12基因片段装入表达载体(载体示意图见图1)。挑选7个转化后的单克隆重组子提取质粒后进行限制性内切酶酶切鉴定，结果显示(见图4C)，重组子1、3、7、8的质粒经酶切后，检测到了大小约12 kb的载体片段和2.5 kb的目的片段，表明其为阳性克隆，证实载体构建成功。

A：启动子Ppatatin1、hIL12基因2和Ppatatin+hIL12 3片段电泳图，条带大小分别为1、1.6、2.6 kb；B：pCambia2301-MCS载体Hind III+ Sac I双酶切电泳图；C：重组表达载体Hind III+ Sac I双酶切鉴定电泳图，1～8为不同单克隆。图4 表达载体构建与鉴定电泳图

3 讨论

目前，用于重组药用蛋白研究和生产的生物反应器有原核生物反应器[8]、酵母生物反应器[9]、动物生物反应器[10]和植物生物反应器[1]。相比于微生物反应器，植物生物反应器由于具有与动物细胞相似的真核基因表达机制，表达的蛋白更易具有生物学活性；而和动物反应器相比，植物细胞培养简单，且转基因体系成熟。鉴于植物生物反应器的各种优越性，开发植物生物反应器表达具有应用价值和应用潜力的药用蛋白受到了许多科研工作者的重视[1, 5,11]。但是，相比于微生物反应器的高效性，植物表达系统的外源蛋白表达量太低[5， 12]，大大限制了其发展。启动子是决定外源蛋白能否高表达的重要因素，而选择利用组织特异性的强启动子驱动外源基因，在植物的某一特定组织内获得高表达重组蛋白，是优化植物生物反应器的途径之一[5]。因此，本研究选用马铃薯块茎特异表达的高效启动子Ppatatin驱动hIL12的表达，期望在下一步的研究中获得马铃薯块茎中特异性高表达的重组hIL12，在前期研究[3-4]的基础上提高hIL12的表达量。

本研究通过Genebank数据库搜索patatin基因及其启动子序列，采用生物信息学分析和比较，设计特异性的引物从马铃薯品种中薯1号中成功获得了大小为1019 bp的目的序列，经与数据库同源序列比对表明patatin基因启动子区序列呈现高度保守。通过生物信息学手段对该序列分析和预测，发现该序列具有2处核心启动子区域，具有启动子的特征。在序列结构上，该序列含有TATA-Box、CAAT-Box等转录起始必需元件外，含有4个蔗糖效应元件，2个糖相关元件，这和PATATIN蛋白的表达受到蔗糖诱导相符[13]。该序列还含有2个茎部特异表达相关元件、4个与储藏蛋白表达相关元件以及2个储藏物特异调控蛋白结合位点，符合PATATIN蛋白是马铃薯块茎的储藏蛋白这一特点[14]。

除了启动子因素外，高效和稳定的植物表达载体也是外源蛋白高表达的重要决定因素。本研究选用的pCambia系列载体是转基因植物研究时最常用的表达载体，该载体含有左右2个T-DNA边界，边界内的序列能整合到植物基因组中的随机位置[15-16]。本研究的基础载体pCambia2301-MCS是在pCambia-2301的多克隆位点区加入了组成型启动子CaMV-35S和NOS终止子。因此，本研究首先利用限制性内切酶将载体上的CaMV-35S启动子切下后，再导入启动子Ppatatin和hIL12基因片段。此外，本研究利用重叠PCR技术将Ppatatin片段和hILl2片段拼装在一起后，将2个片段一步连接到母本载体，省去了一步体外连接及转化的操作，简化了载体构建过程。

综上所述，本研究从马铃薯中克隆了块茎特异性高表达的patatin基因启动子并进行了生物信息学分析，然后成功构建了其驱动的hIL12植物表达载体，对提高hIL-12在马铃薯中的表达量和优化马铃薯生物反应器中在药用蛋白表达中的应用具有一定的意义。

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