HMGB1联合MSCs移植对急性心肌梗死大鼠心脏血管生成影响

唐一锋，马 帅，石 蓓

(遵义医学院附属医院 心血管内科，贵州 遵义 563099)

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells ，MSCs)是治疗心血管疾病常用的种子细胞。除了具备干细胞共性外，还具备免疫耐受性，能被外源基因转染等特征。MSCs移植治疗能够促进梗死交界区域微血管生成，改善心肌梗死后的心功能[1]。高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Box-1，HMGB1)是全身和局部炎症的一种关键的调节物，HMGB1可作用于人心脏成纤维细胞(cFbs)表面的RAGE受体促进生长因子如VEGF等表达增加[2]。实验拟在建立大鼠急性心肌梗死模型基础上，通过HMGB1表达，同时联合移植MSCs，观察梗死心肌局部促进血管生成因子表达变化，局部新生血管密度变化情况，证实增加外源性HMGB1是否能够进一步改善局部微环境，促进干细胞的存活及血管生成效应。以期为目前存在的移植归巢至梗死区干细胞数量少且快速凋亡等问题提供解决方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物 体重为100～150g的SD大鼠细胞培养用；96只2～3月龄、体重为200～250g的SD雄性大鼠动物模型，分模型组、MSCs移植组、HMGB1注射组、HMGB1注射+MSCs移植组(n=24只)。由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，经检疫符合国家实验动物标准，证书号：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs体外培养、鉴定 取100～150g 3周龄SD大鼠，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨。用贴壁离心法[5]取得原代细胞。后进行细胞传代。实验用第3～4代细胞。利用流式细胞仪及APC anti-ratCD29、PE anti-ratCD45、PE anti-ratCD90抗体检测鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物。

1.2.2 细胞免疫荧光检测MSCs是否表达HMGB1的受体TLR4和RAGE。

1.2.3 HMGB1干预MSCs后VEGF分泌水平的检测(酶联免疫吸附测定法，ELISA) 取培养第3代MSCs细胞接种于24孔板，加入含HMGB1的培养基，调节HMGB1的浓度分别为0、12.5、25、50、100、200、400、800ng/mL，以0ng/mL HMGB1为对照分别继续培养12、24和48h后，检测培养基上清液中VEGF的分泌水平。

1.2.4 大鼠心肌梗死模型的建立10%水合氯醛按3mL/kg体重腹腔麻醉。小动物呼吸机辅助正压通气，呼吸机潮气量为3mL/100g体重，呼吸频率为100次/min，呼吸比为1∶3。于胸骨左缘3～4肋间打开胸腔。以肺动脉圆锥和左心耳根部交叉点下方约2mm处作为缝扎点结扎左冠脉前降支，按照造模成功后心肌内注射1.0 ×106个MSCs、结扎冠脉左前降支前后腹膜内各注射1次100ng HMGB1(10μg/mL)、MSCs移植联合HMGB1注射的给药方法分别处理，关胸消毒完毕后将大鼠放入单独清洁鼠笼，置于26℃左右的恒温动物房普食饲养。

1.2.5 ELISA法检测术后3、7、28d血清VEGF浓度水平根据ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.6 免疫组织化学检测新生微血管取出28d处死各组大鼠石蜡切片，行免疫组织化学检测CD31阳性细胞，并以此计数微血管。一抗：兔抗大鼠CD31(1∶50；1∶100；1∶200), 二抗：生物素化羊抗兔IgG, 根据Weidner微血管方法计数。

2 结果

2.1 MSCs的培养、鉴定 原代培养过程中观察可见密集圆形细胞，含各种骨髓原始细胞。第3天换液，可见部分细胞贴壁，可见有少量细胞由圆形变为多角形或短棒状，呈集落状分布；至7d左右，全部细胞均为梭形，且呈涡流状，排列细胞部分融合，可铺满瓶底达80%～90%。细胞传至第3代时，倒置显微镜下可见细胞形态逐渐均匀生长成为梭形，形态趋于一致，且分布均匀。细胞的增殖速度较原代明显增快，当细胞传代至4代以后，细胞生长趋于缓慢，形态有衰老趋势(见图1)。

A：原代第1天细胞(×200)；B：原代培养5d MSC(×40)；C：第2代培养10d MSC(×100)；D：第3代培养25d MSC(×200)。图1 MSCs培养结果

MSCs培养至第3～4代，选取生长状态较好的细胞(6.0 ×106)，用流式细胞仪做细胞表面标记的鉴定，结果显示：CD45、CD29、CD90的阳性率分别是2.7%、99.1%、91.6%,提示培养细胞为MSCs(见图2)。

2.2 MSCs内HMGB1受体表达测定 取状态良好的P3MSCs接种至6孔板中，细胞免疫荧光检测，结果TLR4主要表达于MSCs胞浆内，而RAGE主要表达于细胞核内(见图3)。

流式细胞仪分析显示多数MSCs细胞表达CD29和CD90，极少数细胞表达CD45。图2 流式细胞术鉴定MSCs

图A、B、C箭头所指绿色荧光为TLR4；图D、E、F箭头所指绿色荧光为RAGE受体；PAPI复染细胞核发蓝色荧光。图3 免疫细胞化学检测MSCs内HMGB1受体的表达

2.3 HMGB1干预MSCs后对VEGF分泌水平的影响 ELISA检测不同浓度梯度HMGB1干预的MSCs后不同时间点(12、24、48h)培养基上清中VEGF的分泌，结果(表1，图4)显示：同一时间点,其中12.5至200ng/mL HMGB1干预MSCs后，VEGF的分泌量较对照组显著增加，具有统计学意义(P﹤0.05或P<0.01)，在25ng/mL时达高峰，而随着HMGB1浓度增大，当浓度为400、800ng/mL时，对其分泌有抑制作用，具有统计学意义(P﹤0.05)。

浓度12hVEGF 浓度24h VEGF 浓度48h VEGF浓度0255.85±6.89564.69±19.92757.92±21.5712.5391.63±6.8**713.68±12.31**849.21±25.77**25408.88±10.67**772.45±15.47**886.07±27.31**50354.94±13.98**728.98±19.23**848.28±19.73**100305.60±8.76**668.11±12.04**790.65±12.47**200295.98±14.82*570.14±15.32*778.17±23.99*400233.37±9.57*526.87±17,35*734.01±19.29*800208.86±9.99*487.76±13,45*716.10±18.98*

**P﹤0.01对比0ng/mL HMGB1，*P﹤0.05对比0ng/mL HMGB1。

图4 HMGB1干预MSCs后不同时间点VEGF的分泌水平

2.4 大鼠急性心肌梗死模型评估 麻醉生效后迅速打开胸腔剥离心包后观察大鼠心肌红润，搏动有力(见图5A)，心率300bmp/min左右(见图6A)，结扎后数秒钟后因静脉回流障碍，可见结扎点平面下心肌组织颜色迅速加深，转为深褐色，随着左前降支缺血随时间逐渐加重，结扎数分钟后可以发现左心室壁运动度显著下降，自心尖部至结扎点平面以下心肌颜色逐渐转为苍白，非梗死区则颜色红润，分界清楚(见图5B)，II导联心电图提示QRS波后J点明显抬高，呈典型弓背样抬高改变(见图6B)，提示心肌梗死模型建立成功。

A：心脏前降支结扎前；B：心脏前降支结扎后。图5 建立大鼠心肌梗死模型

A：大鼠正常心电图 ；B：心脏前降支结扎后大鼠心电图。图6 大鼠心肌梗死前后心电图

2.5 血清血管内皮生长因子(VEGF)水平变化 结果显示，模型组、MSCs移植组、HMGB1注射组、HMGB1注射+MSCs移植组血清浓度则在术后3、7 d均呈升高趋势，第7天血清VEGF浓度水平达峰值，28 d血清VEGF浓度水平降至接近正常对照组水平。其中，第3、7天时间点HMGB1注射+MSCs移植组VEGF水平显著高于MSCs移植组、HMGB1注射组及模型组(P<0.05)；第28天各组间无统计学意义(P>0.05)(见表2、图7)。

组别3 d7 d28 d模型对照组604.48±27.54*639.15±27.34*514.59±23.78**MSCs 移植组705.39±25.58*786.82±21.74*524.34±31.32**HMGB1注射组678.67±23.03*722.16±26.21*540.26±25.57**HMGB1注射+MSCs移植组728.95±24.27890.04±22.67528.35±30.04

A：模型对照组；B：MSCs移植组；C：HMGBI注射组；D：HMGBI注射+MSCs移植组；与HMGB1注射+MSCs移植组相比，3d、7d时间点，*P<0.05；28d时间点，**P>0.05。 图7 各组不同时间点VEGF水平变化

2.6 心肌梗死区新生血管检测 结果显示，HMGB1注射+MSCs移植组梗死区及梗死周围区新生微血管密度(18.95±1.80)比较模型对照组 (6.38±0.25)、HMGB1注射组(9.16±1.10)、MSCs移植组(12.54±1.50)增加，(P<0.05)(见图8、图9)。

A：模型组(×200)；B：MSCs移植组(×200)；C：HMGB1注射组(×200)；D：HMGB1注射+MSCs移植组(×200)。 图8 各组新生微血管密度心肌组织免疫组织化学CD31检测

A:模型对照组;B:MSCs移植组;C:HMGB1注射组;D:HMGB1注射+MSCs移植组,各组与HMGB1注射+MSCs移植组相比P<0.05。 图9 新生微血管密度心肌组织免疫组织化学CD31定量比较

3 讨论

3.1 骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死 本实验仍然采用传统模式MSCs培养方法，细胞增殖分化稳定，细胞免疫表型特征维持较好。根据目前国内外根据MSCs表面抗原特征的鉴定标准[3]，本实验中培养出的MSC通过流式细胞鉴定，大部分细胞表达CD29和CD90，极少量细胞表达CD45，提示培养细胞为高纯度的MSCs。研究表明，MSCs可能通过以下几个方面参与梗死心脏的组织修复：①直接分化为心肌样细胞。体内外研究表明[4]，在激活或移植的MSCs中表达多种心肌细胞特异性标记物，其表型及活性与发育中的胎儿心肌细胞相同。②血管分化、细胞融合作用。在缺血缺氧、炎症反应的微环境中，生长因子和细胞因子刺激下，MSCs能够逐步获得内皮细胞表型，在细胞外基质中形成毛细血管样网络，并表达和分泌血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子[5]。③MSCs旁分泌作用。MSCs可以分泌多种生长因子和细胞因子、血管生成素、趋化因子等[6]。本实验中MSCs移植组与模型对照组相比，梗死交界区可见新生血管数量明显增多，ELISA法检测VEGF浓度水平增高；结合本课题组前期研究结果[7]，MSCs移植入兔心肌梗死模型后能通过增加促修复相关细胞因子水平，促进梗死区心肌毛细血管生长而改善心功能。充分说明了MSCs在急性心肌梗死后梗死区及梗死交界区发挥促血管分化、改善心室重塑的积极作用。

3.2 大鼠心肌梗死模型的影响因素及评估 本实验采用经颈气管切开插管[8]、冠状动脉结扎法，以肺动脉圆锥、左心耳根部交界处沿左冠状静脉下行约2mm为冠状动脉结扎点[9]，结扎深度约1～1.5 mm。以结扎心肌颜色由红润转为苍白、心室壁运动度下降证明低灌注及组织坏死的发生。II导联心电图提示QRS波后J点明显抬高>0.2mV，呈弓背样抬高改变，R波振幅降低，提示模型建立成功[10]。以此作为心肌梗死模型研判标准。

3.3 HMGB1对MSCs旁分泌的影响 有研究证实：MSCs有HMGB1受体TLR4和RAGEmRNA的表达[11]，HMGB1的受体存在MSCs的什么具体部位还不清楚。本实验利用免疫细胞荧光检测证实TLR4存在于MSCs胞浆中；而RAGE存在于MSCs的细胞核里。

组织损伤和(或)炎症时释放较高浓度的HMGB1可能诱导MSCs的趋化，从而参与干细胞的修复[3]。Meng等证明HMGB1可以促进骨髓间充质干细胞的迁移，其可能的机制是TLR4在HMGB1信号通路中起作用，TLR4及其配体可调节MSCs的增殖和分化迁移，并影响MSCs多向潜能的维持。体外实验结果证实：HMGB1可促进MSCs的旁分泌，且呈双向调节，浓度为12.5ng/mL至200ng/mL的HMGB1可以促进MSCs分泌VEGF，且25～50ng/mL时达峰值，相反，随着浓度的增大，400～800ng/mL时抑制MSCs分泌VEGF。其中VEGF随时间的延长而增多。本实验证实了MSCs本身具备较强的内分泌功能，可分泌VEGF等细胞生长因子；同时证实了一定浓度范围内的HMGB1可以促进MSCs旁分泌作用。

体内实验中HMGB1注射+MSCs移植组梗死区免疫组化法检测的新生血管密度及ELISA法检测的血清VEGF浓度水平较模型组、MSCs移植组及HMGB1注射组均增加。在碱诱导角膜新生血管(CNV)的鼠模型中, HMGB1受体TLR4缺乏导致促血管生成因子生成减少，对受伤角膜局部使用HMGB1能通过增加巨噬细胞而促进角膜新生血管形成。结果表明,HMGB1的释放启动TLR4的依赖性应答有助于新血管形成[12]。

HMGB1联合MSCs移植治疗对比单独mscs移植、HMGB1注射治疗对梗死心肌局部VEGF的表达增加，可能对大鼠急性心肌梗死后局部新生血管生成、心功能改善等更为有益。然而MSCs移植后，TLRs通路如何调节MSCs趋化作用和旁分泌诱导作用,以及是否能长时间维持等机制还需进一步研究。

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