髋关节置换术后异位骨化的蛋白质组研究

庄颖峰，张旭鸣，许 玮，林世水，邱美光，林志毅

·论 著·

髋关节置换术后异位骨化的蛋白质组研究

庄颖峰，张旭鸣，许 玮，林世水，邱美光，林志毅

目的 使用蛋白质组方法，通过比较髋关节置换术后并发异位骨化与未并发异位骨化患者血清蛋白，寻找差异表达蛋白，筛选蛋白质标志物。方法 收集2009年8月～2012年3月14例髋关节置换术后患者血清，以髋关节置换术后并发异位骨化(heterotopic ossification,HO)记为HO组，以未并发异位骨化为正常组，蛋白质芯片联合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱 ( SELDI-TOF-MS) 技术检测分析两组蛋白质表达谱，寻找差异蛋白。对每个质荷比峰值进行Wilconxon秩和检验，筛选P<0.05的差异蛋白质峰。结果 检测到154个高质量质谱蛋白质峰，其中质荷比为2748的蛋白点的峰值较正常组明显下调，匹配蛋白质为α-2-HS糖蛋白B链(Alpha-2-HS-glycoprotein chain B，AHSG B-链)。结论 AHSG B-链的低表达与髋关节置换术后并发HO密切相关，可能为HO的敏感蛋白质标志物。

髋关节置换； 异位骨化； 蛋白质组； 胎球蛋白

我国国内自20世纪80年代开展髋关节置换术(hip arthroplasty,HA)以来，随着关节外科技术的日渐成熟，HA在临床上也得到越来越广泛的应用，其并发症也越来越受重视。异位骨化(heterotopic ossification，HO)导致关节疼痛及活动受限，已经成为HA术后的常见并发症[1-2]； 严重的异位骨化导致患髋强直，关节功能丧失，髋关节置换手术失败，对患者的生活质量造成了负面影响。Stoltny等[3]认为90%的全髋关节置换患者都存在发生HO的高危因素。全髋关节置换患者术后HO的发病率在5%～90%[4]。由于HO的病因与病理机制尚未完全了解，临床上需要寻找更为敏感的蛋白质标记物以做出早期诊断。本研究应用蛋白质组学方法分析HA术后并发HO的患者与正常HA术后患者，寻找两者之间的差异表达蛋白。希望所发现的差异表达蛋白能为HO的发生做出早期诊断，解析其发病机制，进而发现HO的特异蛋白质标记物。

材料与方法

1 标本

收集2009年8月～2012年3月14例髋关节置换术后患者血清，其中并发异位骨化7例，记为HO组； 未并发异位骨化7例，记为正常组。HO组病例入选标准： (1) HA术后早期出现的髋周持续性疼痛、轻度肿胀； 不同于伤口痛，无髓内感染征象; 病程进展，关节运动逐渐减小。(2) X线随访发现HO病灶,其Brooker分型[5]均为Ⅰ型; (3) 无严重肝、肾、造血系统、内分泌系统疾病和精神病者。14例HA患者手术切口均取后外侧入路。HO组及正常组中全髋关节置换各4例； 人工股骨头置换各3例。性别及年龄构成： HO组男性6例，女性1例; 平均年龄66.7岁； 正常组男性6例，女性1例； 平均年龄63.3岁。两组间性别、年龄相当。

采集研究对象的外周静脉血5ml，共14份。在无抗凝剂的10ml普通采血试管中室温静置1～2h，使血液凝固析出血清，2 000rpm离心5min，取其上清液加入Eppendorf管，-80℃低温冰箱保存。

2 方法

2.1 主要仪器设备与试剂 蛋白核酸测定仪(Biophotometer 6131，德国Eppendorf公司)； PBS-Ⅱ-PLUS型SELDI-TOF-MS系统(美国Ciphergen Biosystem 公司)； 96孔蛋白质芯片工作平台(Bio-processor，美国Ciphergen Biosystem 公司)； 全自动酶标读数仪(ELX808，美国Bio Tek公司)； 50%乙腈； 50mol/L乙酸钠； 9mol/L尿素(美国Sigma公司)； 2%3-环乙胺-1-丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid,CHAPS，美国Sigma公司)、1%二硫代苏糖醇(trifluoro-acetic acid，TFA，美国Sigma公司)、0.5%三氟乙酸(美国Sigma公司)。

2.2 血清与芯片的预处理 冰浴上30～60min内缓慢溶解实验组及对照组血清，4℃下10 000rpm离心4min。每5μl血清加入10μl U9血清变性溶液(9mol/L尿素，2%CHAPS，1% DTT配制而成)，4℃下600rpm摇床上振荡30min使充分混合。以CM10芯片结合缓冲液(乙酸钠2.051g溶于去离子水中，HCL调节pH值至4.0，定容为500ml，由此配制成50mmol/L乙酸钠)将U9处理后的血清稀释至200μl，摇床上振荡使充分混合(600rpm，4℃，2min)。血清被稀释约40倍。每孔CM10芯片中加入200μl结合缓冲液，室温下摇床600rpm震荡5min，使充分平衡后去除液体，重复平衡1次。

2.3 蛋白质与芯片结合及结合后的处理 取上述经U9处理并稀释过的血清100μl加到芯片上，仔细检查并去除每个孔中的气泡以免其影响蛋白质与芯片的结合。芯片与血清充分反应1h(600rpm摇床上振荡，4℃)后去除样品。每孔加入200μl相应的结合缓冲液，摇床上振荡5min(600rpm，室温)后除去液体。重复该过程2次。用水(纯度HPLC级)200μl快速清洗每个孔1次，用力甩干并将生物处理器倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水。将芯片从生物处理器中取出，自然干燥。每孔点加50%饱和的SPA溶液(SPA的溶剂为50% H2O+50%乙腈+0.5% TFA。将SPA溶解于其溶剂中直至过饱和，13 000rpm离心1min后取上清液，与溶剂1∶1混合即可)1μl，待其自然干燥后重复点加1次。自然干燥即可上机检测。

2.4 SELDI质谱仪参数设置及原始数据采集和输出 首先用已知分子量的标准蛋白质芯片将SELDI质谱系统的分子量误差校正到<0.1%，再将结合好蛋白质的芯片放入质谱仪中进行检测。原始数据由Proteinchip Software 3.2软件采集，设置激光强度为180，检测灵敏度6，检测上限100 000m/z，优化收集数据范围2 000～20 000m/z，信号收集位置从20～80，每个样本取168个点所收集信号的平均值。用Proteinchip Software 3.2软件将原始数据以xlm的格式输出。

3 数据处理与匹配蛋白质的查找

实验数据采用由本研究建立的ZJU-PDAS(ZheJiang University-ProteinChip Data Analyze System)软件分析。原始质谱图上传到服务器,先用小波变换(Undecimated Discrete WavISRt Transform，UDWT)去除质谱仪器本身造成的噪音,修正去除噪音后的质谱图的基线。校正整个图谱的分子量值，用局部极值法找出蛋白值峰，并过滤掉信噪比<4的峰。这时从每个样本中找出来的峰的个数及其本身的质荷比值都不相同。将各个样本中质荷比的差异<0.3%的峰聚为一类。将聚类后只出现在<10%的样本中的峰去掉。再对找出的峰在各个样本中的强度做均一化处理。对预处理完筛选出来的蛋白质峰做进一步的检验分析，Wilconxon秩和检验筛选P值<0.05的差异蛋白质峰。 根据差异蛋白质峰所对应的质荷比，结合芯片提供的等电点范围，检索Swiss-Prot数据库，寻找匹配的蛋白质信息； 从而获得蛋白质名称、基因名称、蛋白质功能、亚细胞定位及组织特异性等信息。

结 果

共检测到154个经过信噪比和强调过滤的高质量质谱蛋白质峰。其中质荷比为2748的蛋白点的峰值较正常组明显下调(表1和图1)，与正常组之间差异有显著意义(P<0.05)。

表1 HO组与正常组差异蛋白质峰

图1 HO组与正常组CM10芯片蛋白质组表达谱比较(质荷比为2748的蛋白点)。检索Swiss-Prot数据库，质荷比为2748、等电点范围为4～14的蛋白点的匹配蛋白质为： AHSG B-链

讨 论

1 AHSG B-链的结构与功能

AHSG B-链是三糖(半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、O-糖苷)所组成的唾液酸，其多肽链部分由27个氨基酸残基组成，含有2个β-折叠[6]。AHSG B-链通过1个二硫键与AHSG A链结合而形成胎球蛋白(AHSG)。AHSG B-链由肝脏合成并分泌入血，并有选择地集中于骨基质； 牙本质中含量高于血浆蛋白。功能上具有钡离子与钙离子亲和力，具有调理作用，可促进细胞内吞，影响骨矿物相。

2 AHSG在正常骨矿化中的作用

Saunders等[7]的一项动物实验发现，绵羊胎儿的骨与软骨组织如骨表面、骨髓中的AHSG呈高表达，表明AHSG可能在胎儿的骨与软骨的发育中起重要作用。研究发现，胎儿的血清AHSG水平远高于出生后，胎龄90d的牛胎儿AHSG水平约为20mg/ml，而成年母牛的AHSG水平约为1mg/ml[8]，AHSG水平的明显变化提示其在胎儿的生长发育中起重要作用。美国的一项研究发现，健康社区老年妇女(年龄70～79岁)血清AHSG水平与髋关节或腰椎骨密度密切相关，AHSG水平每提高平均0.38mg/ml，其髋关节的骨密度测定值就增高0.016g/cm2[9]。Hamlin和Price[10]将脱钙的骨骼置于血清中，观察到重新矿化现象； 但置于含生理浓度的钙、磷溶液中就无法被重新矿化。Toroian和Price[11]更进一步观察到血清中去除AHSG后将无法使去矿化的骨骼重新矿化； 但加入AHSG后骨骼矿化发生了。这些实验有力地阐明了AHSG在骨矿化中的作用，但其机制尚未完全明确。Price等[12]提出了“抑制剂排除”的假说来解释AHSG的体外促矿化作用： 作为强效的钙、磷矿化抑制剂，AHSG在Ⅰ型胶原纤维的外部抑制了羟基磷灰石晶体的形成； 但AHSG不能进入Ⅰ型胶原纤维内部，因而不能与骨矿化基本位点相结合，故Ⅰ型胶原纤维的矿化过程不受抑制。德国最近研究表明AHSG生理作用还表现为防止骺端软骨基质过度矿化，该研究发现AHSG基因敲除小鼠(AHSG-/-)的肢体长骨发育严重障碍、骺板早闭，但其长骨生长面骨密度明显增加[13]。另外，AHSG在人体内的作用由于涉及细胞等机体内、外环境而更为复杂，其生理功能的发挥可能与血管内皮细胞、成骨细胞等有关。

3 AHSG在异常骨矿化中的作用

人体的正常的矿化过程仅发生于骨骼及牙齿。病理性钙化过程发生于全身所有的软组织，最常见于脉管组织； 发生于软组织内的成熟板状骨即为HO。组织的矿化过程为下列3个因素的相互作用： 钙磷浓度、适合矿化的环境以及钙化抑制因子的水平[14]，任何一种因素的失调将可能导致异位骨化、血管钙化的发生。机体内的矿物沉积必须有序进行并精确调节。AHSG可与血液循环中的碱性磷酸钙等矿物盐结合形成水溶性的钙-蛋白颗粒(calciprotein particles,CPPs)，以防止矿物在人体内互相聚集而过度矿化，从而执行其抑制矿化作用。CPPs的矿化过程经历了2个阶段： 初级CPPs为直径约50nm的球形颗粒，由AHSG单体(钙、磷等矿物离子聚集成簇，形成矿化前体，再与AHSG聚合成AHSG单体)聚集而成； 室温下，初级CPPs经历数小时的结构重排形成次级CPPs，直径扩大了约2倍，颗粒形态转变为狭长状； 颗粒核心的AHSG单体聚集更为紧密以确保次级CPPs能持续数天而保持状态稳定，充足的时间有利其生理功能的发挥[15]。过量的含钙、磷等矿化物质的CPPs必须被清除，以防止矿化物质在软组织中的异常沉积。Herrmann等[16]的另一项研究提供令人信服的证据表明，小鼠肝脏枯否细胞及脾脏边缘的巨嗜细胞能够通过A类清道夫受体(scavenger receptor-A，SR-A)激活网状内皮细胞系统迅速地清除CPPs。最近的一项研究首次发现，CPPs能够诱导网状内皮细胞系统表达与分泌TNF-α及IL-1β，产生炎症反应，启动细胞凋亡级联反应导致细胞凋亡，导致病理性钙化[17]。

总之，AHSG水平较低或CPPs水平较高都可能导致病理性钙化[14]。我们的蛋白质组研究首次发现AHSG B-链的低表达与HA置换术后并发HO密切相关，可成为HO的敏感蛋白质标志物。由于AHSG B-链的低表达，导致矿物盐在髋关节周围的软组织周围异常矿化而出现HO。由于本研究样本量较少，可能存在一定的误差，今后的研究需进一步加大样本量。同时我们认为，HO患者血清中AHSG B-链的低表达与AHSG低表达具有正相关性，但仍需后续的研究进一步明确。

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(本文编辑： 贺 羽)

Proteomics study on heterotopic ossification after hip arthroplasty

ZHUANGYing-feng1,ZHANGXu-ming1,XUWei1,LINShi-shui1,QIUMei-guang1,LINZhi-yi2

(1.Department of Emergency Surgery，Provincial Clinical College of Fujian Medical University，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China； 2.Department of Nuclear Medicine，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China)

Objective The paper aims to seek the differentially expressed proteins and sensitive biomarker in the serum of the patients with heterotopic ossification (HO) after hip arthroplasty through comparing with the normal control group which did not occur heterotopic ossification by proteomic analysis. Methods The samples were divided into two groups: HO group and control group. The change of expressions of all proteins was assayed and analyzed by protein array and surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) proteomics technology to seek the differentially expressed proteins. The ratios of mass/charge (m/z) of each peak were tested by Wilconxon rank sum test to seek the protein peak withP<0.05. Results Totally 154 high-quality mass spectrometry protein peaks were detected. The expressions were down-regulated in the protein spot with m/z of 2748 and the matching protein was Alpha-2-HS-glycoprotein chain B (AHSG B-chain). Conclusion The low AHSG B-chain level is closely relative to HO after hip arthroplasty and may be the sensitive biomarker of HO.

hip arthroplasty; heterotopic ossification; proteomics; fetuin

1009-4237(2014)02-0147-04

福建省卫生厅青年科研项目基金资助(2010-2-11)

350001 福建 福州，福建医科大学省立临床医学院、 福建省立医院急救中心外科(庄颖峰，张旭鸣，许玮，林世水，邱美光)，核医学科(林志毅)

R 687.4

A

2013-05-16；

2013-09-09)