参芍口服液对缺血再灌注心肌大鼠MMP-2、TIMP-2 和心肌激酶的影响

刘帆，邸亚丽，纪征，尚小明

论著·基础

参芍口服液对缺血再灌注心肌大鼠MMP-2、TIMP-2 和心肌激酶的影响

刘帆，邸亚丽，纪征，尚小明

基金课题: 河北省中医药管理局中医药类科研计划(No.20013122)

目的观察参芍口服液对心肌缺血再灌注损伤大鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)和心肌激酶的影响。方法选取40只SD大鼠，随机平均分为4组，即假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、参芍口服液组(C组)、瑞舒伐他汀组(D组)，每组10只。C组、D组分别于术前3 d给予参芍口服液8 ml/d、瑞舒伐他汀10 mg/d灌胃，A组、B组给予生理盐水。采用结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min再灌注120 min的方法复制大鼠心肌缺血再灌注模型(假手术组不结扎)。分析各组大鼠心肌HE染色情况、MMP-2和TIMP-2的表达、心肌激酶变化。结果心肌HE染色：A组心肌结构正常，B组心肌细胞破坏最严重，C组心肌细胞破坏程度较B组和D组明显减轻。免疫组化检测：MMP-2蛋白的表达水平A组C组>D组>B组，各组间相比有统计学意义(P<0.05)。大鼠心肌酶：CK的水平A组有很少量的表达，其余各组均有大量表达(P<0.05)；CK-MB、LDH的水平A组

参芍口服液；缺血再灌注；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶抑制因子-2；大鼠

近年来，心肌缺血再灌注损伤已成为冠状动脉内溶栓、冠状动脉搭桥以及介入治疗中常见的严重并发症。参芍口服液是唐山工人医院制备的纯中药复方制剂，其主要成分有丹参、黄芪、当归、赤芍、川芎等，具有活血化瘀、通络的功效，已经证实对冠心病、高血脂、心绞痛患者有一定的疗效[1]。目前尚没有关于参芍口服液对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在心肌缺血再灌注方面的研究。本研究采用结扎左冠状动脉前降支的缺血再灌注模型大鼠, 研究参芍口服液对大鼠心肌MMP-2和基质金属蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)蛋白表达的影响, 探讨其保护作用的可能分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物： 健康雄性SD大鼠，清洁型，共40只，体质量(250±50) g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供, 合格证号:SCXK-(军)-2009-003。

1.1.2 药品及试剂： 参芍口服液(唐山工人医院制药室)，瑞舒伐他汀钙(南京正大天晴制药有限公司生产)。MMP-2和TIMP-2兔抗鼠多克隆一抗工作液(美国Bioword技术公司生产)，SP免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色液(福州莱博生物技术有限公司生产)。

1.1.3 实验仪器： 呼吸机(美国CWE公司生产)，Powerlab数据采集分析系统(澳大利亚ADInstruments公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制作： 动物称重，用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射彻底麻醉后，左上肢和双下肢经皮插入针形心电图电极, 连接Powerlab数据采集分析系统，调试参数。经口气管插管连接呼吸机辅助呼吸(频率90～100次/min，潮气量8～10 ml/min)，沿胸骨左缘4～5肋间水平切开肋间肌肉组织，用开睑器撑开肋骨暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支(假手术组不结扎)，此时心电示波可见ST段弓背向上抬高，30 min后放开缝线，可见ST段回落，幅度大于50%，120 min后从颈内动脉取血后处死大鼠。

1.2.2 分组及给药方法： 实验动物随机分为4组，即假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、参芍口服液组(C组)、瑞舒伐他汀组(D组)，每组10只。C组、D组分别于术前3 d给予参芍口服液8 ml/d、瑞舒伐他汀10 mg/d(溶于8 ml生理盐水中)灌胃，A组、B组给予等体积生理盐水，本实验参考陈奇主编的《中药药理实验方法学》进行人与大鼠用药剂量的换算。

1.3 检测指标

1.3.1 HE染色： 心肌组织经过4%的多聚甲醛固定(48 h以上)、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋制成蜡块后切片，经梯度酒精脱蜡至水后行苏木素5 min、盐酸酒精15 s、自来水冲洗至核呈蓝色，95%乙醇2 min、伊红1 min染色，后经梯度酒精脱水透明后封片，观察心肌组织变化。

1.3.2 免疫组化检测MMP-2、TIMP-2： 石蜡切片后常规脱蜡至水;于沸腾的枸橼酸缓冲液中进行抗原修复5 min后自然冷却，PBS洗3次; 3%H2O2阻断10 min，PBS洗3次; 滴加5%BSA封闭液，室温孵育15 min，不洗；加一抗工作液4℃冰箱过夜18～24 h，PBS 洗3次;滴加二抗工作液，37℃烤箱中孵育15 min，PBS洗3次；滴加试剂SP，37℃烤箱中孵育15 min，PBS洗3次；DAB显色液，室温下避光孵育，当看到组织细胞着棕黄色后，立即放入蒸馏水中终止反应；苏木素复染；脱水、透明、封片。MMP-2、TIMP-2的蛋白阳性表达呈棕黄色均位于心肌细胞胞浆。光学显微镜下观察6个高倍视野并采集图像，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像分析，计算指定区域的面积(area)以及该区域内部特定染色部分的累积光密度(IOD)，从而计算出该区域内特定染色物的平均光密度(mean density=IOD/area)。

1.3.3 心肌激酶： 自大鼠右侧颈内动脉抽血后离心，取上层血清，检测每组大鼠血清中心肌酶CK、CK-MB、LDH的含量，化验仪器为Beckman-couter All 5800 全自动生化分析仪，化验试剂由该仪器同厂家提供。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 17. 0软件统计分析处理。计量数据用均数±标准差表示,比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌HE染色比较 A组：心肌细胞形态结构正常，肌丝完整无断裂；B组：心脏组织结构破坏严重，心肌间质水肿明显，心肌细胞萎缩，纤维断裂，心肌损伤严重；C组：心肌细胞形态、胞质、间质及横纹较为正常，个别心肌细胞水肿，心肌损伤较轻；D组变化介于B、C组之间(图1见封3)。

2.2 免疫组化检测MMP-2、 TIMP-2比较 免疫组化检测MMP-2：A组有很少量的表达，B组表达量最多，C组较B组明显减少，D组介于B组和C组之间，且各组间相比差异有统计学意义(P<0.05)(图2见封3)；免疫组化检测TIMP-2:A组有大量的表达，B组有很少量的表达，C组较B组明显增多，D组介于B组和C组之间，且各组间相比差异有统计学意义(P<0.05)(图3见封3)。见表1。

表1 各组大鼠MMP-2和TIMP-2的OD值

注：与A组相比,aP<0.01;与B组相比,bP<0.0;与C组相比,cP<0.05

2.3 心肌激酶比较 心肌细胞磷酸肌酸激酶(CK)除A组有很少量表达外，其余各组均较高且组间无明显差异，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及乳酸脱氢酶(LDH)释放量A组有很少量表达，B组表达最多，C组较B组有明显减少，D组介于B组和C组之间且各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠心肌酶的变化

注：与A组相比,aP<0.01;与B组相比,bP<0.01;与C组相比,cP<0.01

3 讨 论

目前，我国急性心肌梗死(AMI)的介入治疗已极为广泛，经皮冠状动脉介入(PCI)治疗前均会使用一定剂量的抗凝抗血小板和降脂稳定斑块的药物，尽管可造成不同类型不良反应，尤其存在1%～2%致命性出血和一过性肝损伤等并发症，但这些药物的应用已被肯定，成为介入治疗前后的必用药物[2]。参芍口服液是尚小明[3]及多名心内科专家根据多年临床经验独创的处方,具有活血化瘀，益气通络的功效，对于气虚血瘀，脉络闭阻所致的胸痹、心痛证十分有效。前期实验中发现，参芍口服液可通过上调脂联素水平，下调瘦素水平，发挥抗动脉粥样硬化作用[4]；亦可通过调脂、抑制氧化应激和炎性反应等多条途径发挥抗主动脉粥样硬化的作用[5]；在大鼠心肌梗死模型中，参芍口服液能降低急性心肌梗死急性期血清 MDA 含量，提高T-SOD 活性，具有清除氧自由基作用，从而发挥心肌保护作用[6]。目前对于急性缺血再灌注方面的研究较少。

研究表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloprotei-nases，MMPs)参与血小板聚集、心肌缺血再灌注损伤等急性过程。在多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、心室重构[7]、动脉损伤后新生内膜形成中发挥重要作用。适当抑制MMPs有望成为治疗心血管疾病的药物靶点[8]。MMP-2 和 TIMP-2 作为心肌组织中内源性的细胞因子，参与到细胞外基质降解、介导炎性反应、调节血管功能、影响细胞凋亡与存活等众多病理生理过程，这些过程均在心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要作用[9～11]。本实验结果发现：C组MMP-2蛋白的表达明显低于B组，TIMP-2表达明显高于B组，心肌组织的破坏较B组明显减轻，心肌酶CK-MB、LDH水平明显低于B组，而D组的表达介于B、C组之间；说明参芍口服液是通过降低MMP-2、升高TIMP-2的表达从而实现对心脏缺血再灌注损伤的保护作用。

综上所述，参芍口服液由丹参、黄芪、当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、地龙、水蛭、清半夏等珍贵药材配制而成，每味草药均有自己的独特功效[12～16]。本方重用丹参为君药，活血止痛，养血安神；黄芪甘，微温，有益气固表、利水消肿之功效；当归补血活血，两药配合君药，有活中兼养、祛瘀不伤血之妙，是为臣；川芎、赤芍、桃仁、红花活血通络；地龙、水蛭虫类药，长于行散走窜，通经活络；清半夏燥湿化痰，降逆止呕；以上均为佐药。几味药合用，活血化瘀，益气通络，能增加外周血流量，抑制炎性反应、保护血管内皮，抗血栓等作用，对于临床上常见的胸闷刺痛，心悸气短，倦怠乏力等冠心病、心绞痛症状有特效，对介入治疗心肌梗死的患者术后出现的再灌注损伤有保护作用，且较证据确凿的他汀类药物作用更明显。

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EffectsofShenshaooralliquidonMMP-2,TIMP-2expressionandmyocardialenzymeofmyocardiumischemiareperfusioninrats

LIUFan*,DIYali,JIZheng,SHANGXiaoming.

*HebeiUnitedUniversityGraduateAcademy,HebeiProvince,Tangshan063000,China

SHANGXiaoming,E-mail:Shxm@vip.163.com

ObjectiveTo observe the effect ofShenshaooral liquid on myocardial ischemia reperfusion injury, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 (TIMP-2)and myocardial kinase of rat model.Methods40 SD rats were randomly divided into 4 groups, namely sham operation group (A group), ischemia reperfusion group (B group) andShenshaooral liquid group (C group) and rosuvastatin group (D group), 10 rats in each group. C group and D group were given 3 days ofShenshaooral liquid for 8 ml/d, rosuvastatin 10 mg/d orally before operation, A group, B group

saline. By using the method of the left coronary artery ligation on rats anterior descending artery for 30 min, then reperfusion for 120 min to replicate myocardial ischemia reperfusion rats model (sham operation without ligation). Analyze rat myocardial HE staining, MMP-2 and TIMP-2 expression and myocardial kinase changes.ResultsMyocardial HE staining: A group myocardial structure was normal, the most serious damage to myocardial cells was in B group, C group’s myocardial cell damage was milder than that in group B and D group. Immunohistochemical detection: MMP-2 protein expression level was A group C group >D group >B group, there was statistical significance among each group (P<0.05). Rat myocardial enzyme: level of CK expression was very small in A group, the other groups were expressed a lot (P<0.05); CK-MB, LDH level: A group

Shenshaooral liquid; Ischemia reperfusion; Matrix metalloproteinase 2; Tissue inhibitor of metalloproteinase 2;Rets

063000 河北唐山，河北联合大学研究生院(刘帆)； 唐山工人医院心内一科(邸亚丽、纪征、尚小明)

尚小明，E-mail:Shxm@vip.163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.09.016

2014-06-08)