葡萄霜霉病菌PCR检测方法的建立与应用

秦文韬，黄晓庆，孔繁芳，王忠跃，张 昊

(中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

葡萄霜霉病菌PCR检测方法的建立与应用

秦文韬，黄晓庆，孔繁芳，王忠跃*，张 昊*

(中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(BerketCurtis) Ber.etde Toni]细胞色素c氧化酶亚型2(cytochrome c oxidase Ⅱ，cox2)的基因序列进行同源性比对分析，设计合成了一对用于P.viticola的检测引物F-Pv/R-Pv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌(包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌)的基因组DNA进行了PCR扩增，验证引物F-Pv/R-Pv的特异性，结果表明：该引物特异性强，仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600bp左右的特异性条带，其他参照菌株及阴性对照均无任何条带；灵敏度验证结果表明，该检测法可以检测出3.3pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA；应用该方法对来自全国不同葡萄产区的不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测，结果表明，该检测法适用范围广，且检测准确率达100%。

葡萄霜霉病菌；cox2； 聚合酶链式反应； 检测

葡萄霜霉病是世界和我国葡萄的第一大病害，发生面积逐年扩大，成为优质葡萄生产的重要限制因素，一般年份可减产10%～20%，严重的可达70%～80%，并严重影响第二年产量，是现阶段制约世界和我国葡萄产业的一大瓶颈[1]。葡萄霜霉病菌属鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉目、霜霉科、单轴霉属的一种专性寄生真菌，该病菌主要侵染植株的幼嫩器官，如嫩叶、嫩梢和幼果。如果防治不及时，霜霉病会导致葡萄植株叶片脱落，枝梢扭曲，对葡萄树势、产量和品质都有很大的影响。该病在春夏季多雨潮湿的地区，如欧洲、日本、新西兰、南非、阿根廷、澳大利亚东部以及我国的大部分地区均有发生[2]。

真菌的某些基因序列，如ITS序列，β-tublin(TUB) 基因，cox2基因等，在种内不同菌株间具有高度的保守性，又在属间和属内不同种间存在着丰富的多态性，利用这一特性对该基因进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来进行植物病原真菌的分子检测是目前被广泛接受的一种技术，PCR技术凭借其快速、准确、重演性好的优点已经成为植物病原检测的核心技术，得到越来越广泛的应用[3-5]。

本研究旨在建立葡萄霜霉病菌PCR检测技术，以期为葡萄霜霉病的综合防控提供新的思路，推动葡萄产业健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采用的葡萄霜霉病菌B1～B6待检的78份葡萄霜霉病样品(表1)分别采自全国不同葡萄种植区(全国15个省，2个直辖市，3个自治区)和不同葡萄品种，引物特异性验证试验中供试的24种参照菌株来源见表2。

表1田间样品的来源

Table1Sourcesofthesamplesinthefield

菌株编号Strainnumber菌株来源Source葡萄品种Variety菌株编号Strainnumber菌株来源Source葡萄品种Variety菌株编号Strainnumber菌株来源Source葡萄品种Variety菌株编号Strainnumber菌株来源Source葡萄品种Variety1河北石家庄巨峰21甘肃兰州红地球41北京通州黄意大利61黑龙江哈尔滨京秀2广西南宁巨峰22河南郑州红地球42北京通州红宝石无核62河北石家庄藤稔3山西太谷巨峰23河北保定红地球43北京通州巨玫瑰63河北秦皇岛赤霞珠4河北秦皇岛巨峰24宁夏银川红地球44北京通州香妃64河北张家口西拉5湖南洪江巨峰25江苏南京红地球45北京通州无核白鸡心65河北廊坊秋黑6湖北武汉巨峰26安徽合肥红地球46北京通州甲斐乙女66河北廊坊黄意大利7四川成都彭镇巨峰27天津武清红地球47北京通州奥迪亚67河北廊坊莫丽莎8河北保定巨峰28山西太谷红地球48北京通州维多利亚68河北廊坊夏黑9甘肃兰州巨峰29四川成都彭镇红地球49北京通州京早晶69山东济南贵妃玫瑰10河南郑州巨峰30河北廊坊红地球50北京通州魏可70山东青岛紫脆无核11四川成都永安镇巨峰31河北保定红地球51北京通州无核早红71北京大兴玫瑰香12北京通州巨峰32四川成都永安镇红地球52湖南岳阳宝石72天津武清维多利亚13安徽合肥巨峰33北京大兴红地球53湖南岳阳红宝石73广西罗城毛葡萄14福建福州巨峰34辽宁大连红地球54湖南岳阳夏黑74广西金州毛葡萄15河北廊坊巨峰35新疆石河子红地球55湖南怀化刺葡萄75宁夏银川霞多丽16云南大理红地球36北京通州红地球56湖南洪江夏黑76浙江磬安藤稔17河北石家庄红地球37北京通州美人指57湖北武汉夏黑77浙江余姚藤稔18河北秦皇岛红地球38北京通州贵妃玫瑰58黑龙江哈尔滨红香水78福建福州京亚19辽宁熊岳红地球39北京通州奥古斯特59黑龙江哈尔滨无核白鸡心20湖北武汉红地球40北京通州里扎马特60黑龙江哈尔滨山葡萄

表2引物F-Pv/R-Pv特异性验证所用菌株及其PCR检测结果

Table2StrainsusedforspecificityvalidationofF-Pv/R-PvandtheirresultsofPCRamplification

菌株编号Number拉丁学名Latinname寄主(品种)Host(Variety)菌株来源SourcePCR结果PCRresult菌株编号Number拉丁学名Latinname寄主(品种)Host(Variety)菌株来源SourcePCR结果PCRresultB1Plasmoparaviticola葡萄(巨峰)中国吉林+B4P．viticola葡萄(魏可)中国辽宁+B2P．viticola葡萄(藤稔)中国山东+B5P．viticola葡萄(秋黑)中国湖北+B3P．viticola葡萄(京亚)中国河北+B6P．viticola葡萄(夏黑)中国广西+1Plasmoparasp．地锦(未知)德国法兰克福-13Phytophthorainfestans马铃薯本实验室保存-2Plasmoparasp．地锦(未知)德国法兰克福-14Ph．boehmeriae棉花本实验室保存-3P．halstedii向日葵法国马泽维尔-15Pythiumsp．芦笋本实验室保存-4Plasmoparasp．向日葵(703)德国法兰克福-16Peronosporafarinosa未知本实验室保存-5P．halstedii向日葵(701)法国马泽维尔-17Guignardiabidwellii葡萄本实验室保存-6P．halstedii向日葵(未知)法国马泽维尔-18Conielladiplodiella葡萄本实验室保存-7P．obducen凤仙花南斯拉夫-19Botryotiniafuckeliana葡萄本实验室保存-8P．muraris地锦德国法兰克福-20Botryosphaeriarhodina葡萄本实验室保存-9P．angustiterminalis苍耳本实验室保存-21B．dothidea葡萄本实验室保存-10Albugoportulacae苋菜本实验室保存-22Uncinulanecator葡萄本实验室保存-11Phytophthoraparasitica烟草本实验室保存-23Colletotrichumgloeosporioides葡萄本实验室保存-12Ph．capsici辣椒本实验室保存-24Pestalotiamangiferae葡萄本实验室保存-

1.2 葡萄霜霉病菌基因组DNA的提取及cox2基因扩增、测序

参考Xin等[6]报道的植物组织基因组DNA快速提取方法，略有改动。具体步骤如下：用已灭菌的牙签或枪头刮取少量霉层置于0.5 mL PCR管中，加入50μL Buffer A溶液(100mmol/L NaOH，2%Tween®20，Buffer A用10mol/L NaOH和20%Tween®20现配现用)，95 ℃温育10min；然后加入50μL Buffer B溶液(100mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA)，振荡混匀，12 000r/min离心15 s，得到含有葡萄霜霉病菌基因组DNA溶液，-20℃保存备用。

PCR反应体系(20μL)：DNA模板1μL，10μmol/L的引物各1μL，20%PVP(W/V) 1μL，2% BSA(W/V) 1μL，2×PCR Mix 10μL，无菌水5 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，50℃退火30s，72 ℃延伸1min，35个循环；最后72 ℃延伸10min。

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，产物用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化，经pGM-T载体连接，并转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，蓝白斑筛选阳性菌落，最后将筛选到的含有正确插入片段的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 特异性引物的设计

本研究根据已测序的结果、GenBank中已报道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列(DQ365760.1、EF426553.1、HM628744.1、HM628749.1等)，同时与已报道的Plasmoparaangustiterminalis(EU743812.1)、P.halstedii(EU743813)、P.penniseti(EF426475)、Peronosporaaparines(DQ365717)、Phytophthoracapsici(GU221961.1)、Pythiumadhaerens(HQ680578.1)等多种霜霉目真菌、常见的葡萄致病菌的cox2基因序列进行比对分析，根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计特异性的PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 引物特异性验证

分别以6种靶标菌株DNA和24种参照菌株DNA为模板，用特异性引物F-Pv/R-Pv进行PCR扩增，反应体系及程序同1.2，设置水为模板的阴性对照，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。

1.5 引物灵敏度验证

用核酸浓度测定仪(Gene公司，NanoVue Plus)测定所提取的P.viticola基因组DNA浓度，并采用浓度梯度稀释法将其稀释到1～10-6ng/μL，然后利用特异性引物F-Pv/R-Pv，按1.2的反应体系和程序分别对梯度稀释的P.viticola基因组DNA进行PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。

1.6 田间葡萄叶片组织中霜霉菌的检测

按1.2所述的方法分别提取待检样品的DNA，并分别以所提取的待检样品的DNA、健康葡萄叶片DNA、水为模板，用特异性引物F-Pv/R-Pv进行PCR扩增，反应体系及程序同1.2，取5 μL扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

2 结果与分析

2.1 特异性引物设计

将测序获得的P.viticola菌株cox2基因序列与GenBank中其他菌株的cox2基因序列进行比对分析，根据序列之间的同源性和差异性，设计了P.viticola的特异性引物F-Pv/R-Pv(表3)，目的片段大小约为600bp。

表3葡萄霜霉病菌cox2基因PCR扩增引物序列
Table3Primersequencesofcox2gene

引物名称Primer引物序列Sequence(5′⁃3′)F⁃PvCAAGATCCAGCAACTCCAGTTATGGAR⁃PvACATTGTCCATAAAAAACACCTTGT

2.2 引物特异性验证

以所提取的30种菌株DNA为模板(表1)，用所设计的特异性引物F-Pv/R-Pv进行PCR扩增，电泳检测结果显示：仅模板为P.viticola基因组DNA时，PCR扩增产物呈现出一条600bp左右的特异性条带，与预期结果一致，而对其他24种参照菌株和阴性对照均为阴性，无任何条带，其中有16种为霜霉目真菌(包括9种Plasmopara属真菌)，另外8种为其他目的常见葡萄致病菌(图1)。特异性检测结果表明，所设计的引物具有种间的相对特异性，能够区别P.viticola与其他Plasmopara属的病原真菌，同时，具有属间相对特异性，能够区别其与霜霉目的其他部分真菌及其他葡萄上常见的病原菌。

图1 引物F-Pv/ R-Pv特异性验证结果Fig.1 Specificity validation of F-Pv/ R-Pv

2.3 引物灵敏度验证

用特异性引物F-Pv/R-Pv分别对不同浓度梯度的P.viticola基因组DNA进行扩增，设置无菌水为模板的阴性对照，结果显示：随着模板浓度的降低，琼脂糖凝胶电泳条带亮度逐渐变暗，模板浓度为3.3pg/μL的葡萄霜霉病菌基因组DNA的PCR扩增产物还能分辨出一条约600bp的特异性条带(图2)，而模板浓度小于3.3pg/μL以及无菌水对照均无明显的扩增产物，说明PCR法的灵敏度为3.3pg/μL。

2.4 发病叶片组织中葡萄霜霉病菌的检测

用特异性引物F-Pv/R-Pv对来自于全国不同葡萄生态区域的78份葡萄霜霉病样品DNA、健康葡萄叶片DNA、水分别进行了PCR扩增，电泳检测结果显示，各地区的78份样品均呈阳性，均出现了预期的目标条带，条带的亮度因模板浓度的不同有所差异，而健康葡萄叶片DNA和水作模板的阴性对照未出现目标条带(图3)，检测准确率为100%，说明引物F-Pv/R-Pv能特异性地检测到发病叶片组织中的P.viticola基因组DNA的存在。

图2 引物F-Pv/ R-Pv灵敏度验证结果Fig.2 Sensitivity validation of F-Pv/ R-Pv

图3 田间霜霉菌cox2基因的扩增结果Fig.3 PCR products of cox2 of Plasmopara viticola collected from fields

3 讨论

葡萄霜霉病菌属于专性寄生菌，很难进行常规的分离培养，关于P.viticolaPCR检测方面的相关报道较少，然而，PCR检测技术在霜霉目真菌中的应用已很广泛，如Ioos等[7]建立的P.halstediiPCR检测体系，能特异性地检测出P.halstedii，灵敏度为3pg；Tooley等[8]建立的PhytophthoraPCR检测体系，三种大小不同的PCR产物可以用于检测马铃薯叶片和块茎内三种不同的致病菌，检测灵敏度为1～10pg，为种薯和贮藏马铃薯内P.infestans的检测提供了有力工具；刘春来等[9]建立的大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)PCR检测方法可以检测出接种于土壤中的0.3个大豆疫霉菌游动孢子和0.06个卵孢子，对染病组织的检测也表现出了较高的灵敏度，这都为本研究葡萄霜霉病菌PCR检测法的建立提供了借鉴。

本研究通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列进行同源性比对分析，设计合成了一对用于P.viticola检测的引物F-Pv/R-Pv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌(包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌)的基因组DNA进行了PCR扩增，验证引物F-Pv/R-Pv的特异性，结果表明：该引物特异性强，仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600bp左右的特异性条带，其他参照菌株及阴性对照均无任何条带；灵敏度验证结果表明，该检测法可以检测出3.3pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA；应用该方法对来自全国不同葡萄产区不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测，结果表明，该检测法适用范围广，且检测准确率达100%。

[1] 王忠跃.中国葡萄病虫害与综合防控技术[M].北京: 中国农业出版社,2009.

[2] 李海强.石河子地区葡萄霜霉病的发生规律及防治研究[D].新疆: 石河子大学,2009.

[3] 王娜,马雅军,王喆之,等.PCR相关技术方法在植物病害检测中的应用[J].上海农业学报,2004,20(4): 112-115.

[4] 赵杰.序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西农业科学,2004(4): 35-37.

[5] 刘春来,文景芝,杨明秀,等.rDNA-ITS在植物病原真菌分子检测中的应用[J].东北农业大学学报,2007,38(1): 101-106.

[6] Xin Z G,Velten J P,Oliver M J,et al.High-throughput DNA extraction method suitable for PCR[J].BioTechniques,2003,34(4): 820-826.

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[9] 刘春来,杨明秀,文景芝.大豆疫霉菌ITS分子检测程序的建立及其应用[J].微生物学通报,2007,34(6): 1158-1162.

EstablishmentandapplicationofPCRfordetectionofPlasmoparaviticola

Qin Wentao, Huang Xiaoqing, Kong Fanfang, Wang Zhongyue, Zhang Hao

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

This study designed a pair of primers F-Pv/R-Pv forPlasmoparaviticoladetection based on the differences among sequenced and reportedcox2 gene sequences ofP.viticola.Totally 30kinds of plant pathogens,including 15 kinds of fungi belonging toPlasmoparaand 8 kinds of grape pathogens,were screened to validate the primers F-Pv/R-Pv.The results showed that the primers F-Pv/R-Pv were of high specificity,and only a single product of about 600bp was amplified fromP.viticolagenomic DNA.The sensitivity of the detection was 3.3pg/μL genomic DNA per 20μL PCR reaction volume.Genomic DNAs of 78 samples from different grape plantation areas in China were specifically detected by PCR assay with F-Pv/R-Pv,suggesting that this method was applicable to a wide scope with 100% detection accuracy rate.

Plasmoparaviticola;cox2; PCR; detection

2013-04-12

：2013-05-07

公益性行业(农业)科研专项(201203035)；国家现代农业产业技术体系专项基金(nycytx-30)

S 436.631

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.019

致谢：Aleksandra Bulajic、Renaud IOOS、Tim Schubert、Otmar Spring等教授为本研究提供了宝贵的参照菌株DNA，国家葡萄产业

技术体系许多综合试验站为本研究提供了葡萄霜霉病样品，在此一并表示感谢！

* 通信作者 Tel：010-62815926，E-mail: wangzhy0301@sina.com； Tel：010-62815613，E-mail: hzhang@ippcaas.cn