苜蓿锈菌夏孢子的生物学特性及杀菌剂对其室内毒力测定

雒富春， 袁庆华， 王 瑜， 沈慧敏*

(1.甘肃农业大学草业学院，兰州 730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

苜蓿锈菌夏孢子的生物学特性及杀菌剂对其室内毒力测定

雒富春1， 袁庆华2*， 王 瑜2， 沈慧敏1*

(1.甘肃农业大学草业学院，兰州 730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

采用孢子萌发法对引起苜蓿锈病的病原菌进行了生物学特性研究，并采用不同的杀菌剂进行了室内毒力测定。研究表明：在100%相对湿度下，苜蓿锈菌夏孢子在5～30 ℃都能萌发，但温度在20～25 ℃萌发最快；光照和1%葡萄糖液有促进孢子萌发的作用；不同杀菌剂室内毒力测定研究表明，吡唑醚菌酯和嘧菌酯效果最好，其EC50分别为0.040 1、0.068 1 mg/L。

苜蓿锈病； 生物学特性； 杀菌剂； 毒力测定

苜蓿是世界分布最广泛的牧草，号称“牧草之王”[1-2]，不仅产量高，而且草质优良，为各种畜禽所喜食[3]。随着苜蓿产业的发展，苜蓿种植面积不断扩大，苜蓿病害问题越来越严重，特别是苜蓿锈病(alfalfa rust)在我国的东北、内蒙古、河北、甘肃和新疆等地区发生和危害较为严重，对苜蓿生产造成严重的经济损失[4-5]。

苜蓿锈病是由苜蓿锈菌(UromycesstriatusSchroet)引起的[6-7]，目前有关该菌的生物学特性、致病力及杀菌剂对其夏孢子的影响的报道较少[8]。因此，本文通过研究引起苜蓿锈病的夏孢子的生物学特性及不同杀菌剂对其室内毒力测定，筛选对锈菌夏孢子敏感的抑孢杀菌剂，为苜蓿锈病的发生规律研究和化学防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 苜蓿锈菌夏孢子生物学特性

1.1.1 供试菌种及来源

供试菌种：2012年秋采自中国农业科学院廊坊牧草试验基地。

将采集到的带有苜蓿锈菌的新鲜叶片用0.1%吐温水溶液清洗，配制成在低倍镜下观察每视野40～60个夏孢子的悬浮液备用。

1.1.2 温度对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响

采用水琼脂玻片法[9]研究不同温度对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响。设置5、10、15、20、25、30、35 ℃共7个温度处理，将带有锈菌夏孢子的水琼脂玻片置入带有湿滤纸的培养皿中，然后放入可控温度气候培养箱，每个处理重复3次。由于超过12 h，其孢子萌发芽管交错复杂，很难统计，因此本试验在12 h内统计萌发率(下同)。每4 h观察1次，共观察3次，每次记录孢子萌发数和孢子总数，每重复调查孢子数不少于300个。

1.1.3 光照对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响

方法如1.1.2，在20 ℃下分别设置全光照、2 h光暗交替和全黑暗3个处理，每处理重复3次，每4 h观察1次，共观察3次，分别记录孢子萌发数和孢子总数，每重复调查孢子数不少于300个。

1.1.4 不同环境物质对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响

方法如1.1.2，在20 ℃下设置无菌蒸馏水、1%葡萄糖液、0.5%葡萄糖液、0.1%葡萄糖液、10%苜蓿叶片榨汁液、20%苜蓿叶片榨汁液共6个处理，每个处理重复3次，每4 h观察1次，共观察3次，记录数据并计算孢子萌发率，每重复调查孢子数不少于300个。

1.1.5 数据处理

利用公式(1)计算孢子萌发率，利用SPSS19.0、Excel等软件进行显著性分析。

1.2 不同药剂对苜蓿锈菌夏孢子室内毒力测定

1.2.1 供试药剂

供试药剂及来源见表1。

1.2.2 药剂处理及浓度的配制

首先将供试药剂用二甲基亚砜溶解配制成20 000 mg/L的母液，再用丙酮溶解并稀释成浓度为100、20、5、1、0.2 mg/L的溶液(制剂按有效成分计算)备用。

1.2.3 调查和数据处理

每个处理设置3个重复，同时用无菌蒸馏水作空白对照。12 h后，当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，调查药剂处理孢子萌发率，每重复随机调查孢子总数不少于300个，分别记录萌发数和孢子总数，计算孢子萌发率、校正萌发率、相对抑制萌发率，使用DPS 6.55软件计算EC50、EC90，进行毒力回归分析等。

药剂处理校正夏孢子萌发率(%)=

夏孢子萌发相对抑制率(%)=

表114种杀菌剂及来源

Table1Fourteenfungicidesandtheirsources

药剂Fungicide来源Source95%嘧菌酯TC95%AzoxystrobinTC上海禾本药业有限公司97．7%咪鲜胺TC97．7%ProchlorazTC江苏南通江山农药化工股份有限公司95%福美双TC95%Arasan河北冠龙农化有限公司96．2%烯酰吗啉TC96．2%DimethomorphTC山东先达农化股份有限公司95%吡唑醚菌酯TC95%PyraclostrobinTC巴斯夫欧洲公司97%异菌脲TC97%IprodioneTC江苏兰丰生物化工有限公司96．2%嘧霉胺TC96．2%PyrimethanilTC浙江禾本科技有限公司95%百菌清TC95%ChlorothalonilTC山东大成农化有限公司96%三唑酮TC96%TriadimefonTC江苏省盐城利民农化有限公司97%戊唑醇TC97%TebuconazoleTC上海生农生化有限公司97%苯醚甲环唑TC97%DifenoconazoleTC上海生农生化有限公司50%多菌灵WP50%CarbendazimWP江苏江阴市福达农化有限公司70%甲基硫菌灵WP70%Thiophanate⁃methylWP江苏江阴市福达农化有限公司80%代森锰锌WP80%MancozebWP河北青园农药有限公司

2 结果与分析

2.1 温度对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响

由表2可知，夏孢子在5～30 ℃之间都可以萌发，但超过25 ℃时，随着温度的升高夏孢子的萌发率逐渐下降，当达到35 ℃时，夏孢子失活，不萌发。从萌发时间看，在4 h时，夏孢子在5～25 ℃都能萌发并且随着温度的升高萌发率逐渐升高，20和25 ℃的萌发率极显著高于其他温度的萌发率；在8 h，20～25 ℃时，其萌发率显著高于其他处理；在12 h，10～25 ℃的萌发率显著高于30 ℃和5 ℃，达90%以上。

2.2 光照对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响

不同光照处理对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响见表3，孢子萌发初期(4 h)，全光照和2 h光暗交替对夏孢子萌发有一定的促进作用，其萌发率显著高于黑暗条件下，而随着时间的延长，当孢子萌发时间达到8 h或以上时，黑暗条件下的萌发率和光照条件下萌发率差异不显著，均达90%以上。

表2不同温度对苜蓿锈菌夏孢子萌发率的影响1)

Table2Effectsoftemperatureonthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

温度/℃Temperature萌发率/%Germinationrate4h8h12h531．99eD74．70cC88．02bB1044．35dC88．44bB93．81aA1570．56bB88．62bB93．20aA2085．58aA93．24aA94．80aA2589．79aA93．25aA95．33aA3054．58cC73．27cC81．43cC350fE0dD0dD

1) 表中同列数据后不同小写英文字母表示在0.05水平差异显著；大写英文字母表示在0.01水平差异显著。下同。
Different lower-case letters in the same column indicate significant difference (P<0.05) and capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below.

表3光照对苜蓿锈菌夏孢子萌发率的影响

Table3Effectsoflightonthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

光照条件Lightcondition萌发率/%Germinationrate4h8h12h暗Dark72．40bB92．24aA94．11aA光Light90．90aA95．02aA94．97aA2h光暗交替Alternationoflightanddarkfor2h86．79aA93．95aA95．32aA

2.3 环境物质对苜蓿锈菌夏孢子萌发的影响

由表4可知，不同浓度的葡萄糖液和无菌蒸馏水处理的孢子萌发率相对较高，在12 h分别达96.02%、95.17%、94.11%和94.24%，而叶片榨汁液处理萌发率相对较低，10%和20%叶片榨汁液处理萌发率在12 h仅为84.80%和74.49%。从时间上看，各个处理的夏孢子基本在前8 h萌发，8 h后孢子萌发数较少，其中1%葡萄糖液在前4 h萌发最快，其萌发率已达93.38%，其次是0.5%葡萄糖液(91.03%),两者均极显著高于相同时间其他处理的萌发率，而在8、12 h时与低浓度的葡萄糖液处理以及蒸馏水处理差异不显著。表明在孢子萌发初期，相对较高浓度的葡萄糖液有促进孢子萌发的作用。

表4环境物质对苜蓿锈菌夏孢子萌发率的影响

Table4Effectsofnutritiononthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

处理Treatment萌发率/%Germinationrate4h8h12h无菌蒸馏水Steriledistilledwater84．27abB92．97bAB94．24aA1%葡萄糖1%Glucose93．38aA95．13aA96．02aA0．5%葡萄糖0．5%Glucose91．03aA93．61abAB95．17aA0．1%葡萄糖0．1%Glucose82．94bB91．64bB94．11aA10%榨汁液10%Laminasqueeze79．28cB84．15cC84．80bB20%榨汁液20%Laminasqueeze66．76dC71．81dD74．49cC

2.4 不同杀菌剂对苜蓿锈菌夏孢子室内毒力测定

从不同药剂的EC50(表5)可以看出，吡唑醚菌酯、嘧菌酯、福美双、百菌清、代森锰锌、戊唑醇、苯醚甲环唑对苜蓿锈菌夏孢子有不同程度的抑制作用，共有3种杀菌剂的EC50<1 mg/L，分别为吡唑醚菌酯、嘧菌酯、福美双，其中吡唑醚菌酯的抑制作用最强，EC50为0.040 1 mg/L。由毒力回归方程的斜率反映药剂的敏感度可知，在供试的杀菌剂中，嘧菌酯最为敏感。而咪鲜胺、异菌脲、嘧霉胺、三唑酮、烯酰吗啉、多菌灵和甲基硫菌灵在设置的浓度范围内几乎对夏孢子的萌发没有抑制作用，表明这7种杀菌剂对苜蓿锈菌夏孢子不敏感。

表5不同杀菌剂对苜蓿锈菌夏孢子的室内毒力测定

Table5Toxicitymeasurementofdifferentfungicidesonofalfalfarusturedospores

药剂TestedpesticideEC50/mg·L-1EC90/mg·L-1相关系数Correlationcoefficient毒力回归方程(y=)Regressionequation95%吡唑醚菌酯TC95%PyraclostrobinTC0．04010．08860．93043．7217x+10．199395%嘧菌酯TC95%AzoxystrobinTC0．06810．12810．96614．6667x+10．445895%福美双TC95%ArasanTC0．19270．76880．90392．1324x+0．326295%百菌清TC95%ChlorothalonilTC1．75694．28820．95553．3070x+4．190680%代森锰锌WP80%MancozebWP2．019050．48530．89870．9167x+4．720397%戊唑醇TC97%TebuconazoleTC2．863935．58840．94381．1711x+4．464997%苯醚甲环唑TC97%DifenoconazoleTC7．780223．89860．83252．6295x+2．2658

3 结论与讨论

通过对苜蓿锈菌夏孢子生物学特性的研究及室内毒力测定，结果表明在100%的相对湿度下且在水膜中，苜蓿锈菌夏孢子在5～30 ℃范围内均能萌发，其最适萌发温度为15～25 ℃，当温度达到30 ℃时，夏孢子虽能萌发但产生高度扭曲的畸形芽管，温度达到或超过35 ℃时，夏孢子基本上失活，不萌发，这和余仲东等人[10]研究温度对松杨栅锈菌夏孢子萌发影响的结果具有相似性，松杨栅锈菌夏孢子在低于5 ℃和高于30 ℃时不萌发。不同环境物质对夏孢子萌发的影响研究中可以发现，1%葡萄糖液有利于夏孢子萌发，在4 h萌发率达93.38%，显著高于无菌蒸馏水处理的萌发率，而榨汁液萌发率显著低于无菌蒸馏水处理的萌发率，反映了对夏孢子萌发产生了一定的抑制作用，造成这种原因可能与叶片浸出液中含有一些氧化物、酚类物质有关[11]，郭志青等人[12]在研究落叶松杨栅锈菌夏孢子时也发现，适量的糖分能够促进夏孢子的萌发，但较高浓度的叶片浸出液反而影响孢子的萌发；在研究光照对夏孢子萌发的影响时发现，在孢子萌发初期，温度在25 ℃时光照对孢子萌发没有影响，而当温度在20 ℃时，光照、光暗交替、黑暗条件下在4 h的孢子萌发率分别为90.90%、86.79%、72.40%，可以看出光照对孢子萌发有一定的促进作用，这和梁巧兰[13]等人研究康乃馨锈菌夏孢子生物学特性时得出的光照抑制孢子萌发的结论略有不同，这可能是由于不同种锈菌夏孢子生物学特性有所差异，然而随着萌发时间的加长，在12 h各个光照条件处理的萌发率分别达到94.97%、95.32%和94.11%，差异不显著，因而可以看出在相对较低温度下，光照对夏孢子萌发初期产生一定的促进作用。

有关锈菌毒力测定的研究，20世纪90年代周淑清等[14]在研究影响苜蓿锈菌夏孢子萌发的因素时发现，多效唑和翠竹牌植物生长剂对孢子的萌发有显著的抑制作用，但并没有进行多种杀菌剂的毒力测定。薛明珍等[15]通过小麦活体接种的方法研究小麦锈病防治时，发现丙环唑有较好的效果但其对孢子萌发是否有抑制作用未进行研究说明。本试验进行了14种杀菌剂对苜蓿锈菌夏孢子萌发的毒力测定，研究表明甲氧基丙烯酸类杀菌剂吡唑醚菌酯、嘧菌酯对锈菌夏孢子有较好的抑制作用，对锈菌夏孢子毒力测定EC50分别为0.040 1和0.068 1 mg/L，同时福美双、百菌清和代森锰锌在较低浓度也对夏孢子萌发有较好的抑制作用，因而在实际防治过程中这些药剂可以轮换使用，以免单一药剂的长时间使用产生抗药性问题。但此次药剂试验中，仅在室内做了毒力测定，筛选出了几种效果较好的抑孢杀菌剂，尚未得到室外或大田试验的验证，所以上述几种杀菌剂对苜蓿锈菌的抑菌作用还有待于进一步的明确，以便更科学地指导大田苜蓿锈病的有效防治。

综上所述，在苜蓿锈病防治过程中，应该充分考虑其生物学特性。由夏孢子生物学特性可知，在高温情况下锈病不发生，一般发生在温度较低和湿度较大的春季或秋季，因此，每年应该在春季和秋季对各苜蓿种植区锈病的发生动态提前做好监控或预报，尽量在锈病潜育期或是发生前期进行药剂防治，以防大面积发生，造成不必要的损失。

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Biologicalcharacteristicsoftheuredosporesofalfalfarustandtoxicitytestofdifferentfungicidesinthelaboratory

Luo Fuchun1, Yuan Qinghua2， Wang Yu2， Shen Huimin1

(1.PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The biological characteristics of the uredospores of alfalfa rust were studied using the uredospores germination method. The results showed that the most suitable temperature for germination was 20-25 ℃ under 100% relative humidity；light and 1% glucose solution had promotion effect on spore germination. The toxicity test showed that pyraclostrobin and azoxystrobin had good effects on the uredospores of alfalfa rust, with an EC50value of 0.040 1 mg/L and 0.068 1 mg/L, respectively.

alfalfa rust; biological characteristics; fungicide; toxicity test

2013-11-06

：2013-12-12

“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD17B01)；公益性行业(农业)科研专项(201303057)

S 435.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.017

* 通信作者 E-mail: yuanqinghua@hotmail.com; ndshm@gsau.edu.cn