复合菌剂PS21对氧乐果胁迫下小麦幼苗生长及抗氧化酶的影响

葛红莲, 刘中华

(周口师范学院生命科学与农学学院，周口 466001)

复合菌剂PS21对氧乐果胁迫下小麦幼苗生长及抗氧化酶的影响

葛红莲*, 刘中华

(周口师范学院生命科学与农学学院，周口 466001)

采用溶液培养法研究了不同浓度的复合菌剂PS21与氧乐果协同处理对小麦幼苗生长及抗氧化酶的影响，初步探讨复合菌剂PS21缓解氧乐果对小麦生长和抗氧化酶的抑制效应。研究结果表明，106～108cfu/mL浓度的复合菌剂PS21对氧乐果的毒害具有缓解作用，缓解作用与复合菌剂PS21浓度呈正相关性，菌液浓度为108cfu/mL时，缓解作用明显，与氧乐果单独处理相比，小麦株高、茎粗、干重、湿重、叶绿素含量显著增加；在抗氧化酶系统中随复合菌剂PS21浓度的升高，幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性均有不同程度的提高，丙二醛(MDA)含量下降。同浓度复合菌剂PS21的不同施用方法对氧乐果毒害的缓解作用存在差异，灌根法对氧乐果毒害小麦具有较强的缓解作用。

PS21复合菌剂； 氧乐果； 幼苗生长； 小麦； 抗氧化酶系

小麦是世界主要粮食作物，目前，小麦病虫害的防治仍然以化学农药为主，氧乐果(omethoate),化学名称为O，O-二甲基-S-甲基氨基甲酰甲基硫酐磷酸酯，作为防治小麦蚜虫的骨干药剂被长期大量使用[1]。大量氧乐果进入土壤后，被土壤中的有机质所吸附，并溶于土壤孔隙的水中[2]，很大一部分农药残留在土壤中，造成农药残留的严重超标，对土壤生态环境造成污染，抑制小麦生长和降低小麦品质[3-4]。近年来，有研究表明，过量施用氧乐果农药后，累积在小麦根系的氧乐果对小麦的生长存在影响，小麦幼苗的生长受到抑制，死苗率提高，对小麦产生一系列毒害作用，其机制是在氧乐果胁迫下小麦幼苗体内产生了大量的自由基，这些自由基的积累破坏了小麦体内正常的动态平衡，对小麦体内叶绿素和类胡萝卜素、抗氧化酶等物质产生了严重的破坏作用[5-8]。另有研究表明高剂量的氧乐果将抑制小麦幼苗防御相关酶的活性，但随时间的延长，抑制作用有所降低[7,9]。目前为止，未见报道增强作物对氧乐果损伤的防护作用的措施。

光合细菌是一类能进行不产氧光合作用的原核微生物，具有固碳、固氮、降解转化有机物等生理特性，并且一些菌株还分泌抗病活性因子和生长激素[10-12]。光合细菌已经作为生物菌肥在农业生产上广泛应用，可以提高幼苗叶绿素的含量，增强光合作用，促进植物根系的生长，起到促生壮苗的作用，同时光合细菌还具有抗病、防病效果[13-14]。近年来，有研究表明，一定浓度的光合细菌可以增强植物幼苗的抗逆性，利用光合细菌缓解重金属、紫外线等胁迫对植物幼苗生长及抗氧化酶的影响，提高了植物幼苗的应激能力，促进植物生长[15-17]。但有关复合光合菌剂对氧乐果毒害作物是否有缓解作用，尚未见报道。本文以小麦为材料，研究不同浓度的复合菌剂和氧乐果复合处理对小麦的生长指标和抗氧化酶系的影响，为复合光合菌剂的进一步开发应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要培养基和试剂

光合细菌固体培养基采用基本培养基添加0.15%酵母膏[16]。

40%氧乐果乳油，河北新兴化工有限公司生产。依据文献[5]的研究结果，在5～10 g/L范围内，10 g/L的氧乐果对小麦的毒性效应最为显著，本试验所用氧乐果浓度为10 g/L。

1.2 供试菌株及小麦品种

小麦供试品种为‘周麦18’。光合细菌菌株AR12、AR13是从周口师范学院校园清水河水中经富集、分离和纯化获得，经初步鉴定分别为红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)。

1.3 复合光合菌剂的制备

将在冰箱内保存的菌种AR12、AR13取出，用接种环挑取菌落至灭菌的光合细菌固体培养基表面进行菌种活化，经30 ℃温箱培养5 d后，加少量无菌水将菌苔洗下来制成菌悬液，用平板涂布法进行扩大培养，每菌株涂布10平皿，30 ℃温箱培养3 d后，每平皿加等量无菌水将菌苔洗下制成菌悬液，2种菌按1∶1的比例复配成光合细菌复合菌剂PS21，菌液浓度分别为106、107、108cfu/mL，采用自动彩色菌落计数仪(美国DigiCounter V3)计数。

1.4 试验设计

种子用0.1%HgC12消毒8 min，后用自来水充分冲洗，再用蒸馏水冲洗2～3次，然后将种子放到铺有消毒滤纸的培养皿内，加少量蒸馏水，置于25 ℃光照培养箱在黑暗条件下催芽48 h。选取长势一致的种子种在加有纱布的30 cm×20 cm×5 cm的托盘中，纱布上带有100个人工剪孔，托盘中装有2.5 L 1/2 Hoagland营养液，小麦放于孔中，根部朝下，在人工气候室培养10 d后，加入40%氧乐果，浓度为10 g/L。试验分A、B两组，A组采用叶面喷施法，定期叶面喷施浓度为0、106、107、108cfu/mL的复合菌剂PS21，5 d喷施一次，每次复合菌剂施量为10 mL。B组采用灌根法，在小麦培养液中加入和A组同浓度的复合菌剂PS21。每处理设3个重复，每个重复5托盘苗，以1/2Hoagland营养液处理组的小麦幼苗作为对照。小麦幼苗置于人工气候室内培养，光照时间为12 h/d、昼夜温度30/22 ℃、相对湿度70%，每5 d补一次营养液。在小麦幼苗期(处理10 d后)测定小麦形态指标，并取小麦植株同位叶的叶片测定生理生化指标。

1.5 小麦叶片生长指标及生理生化指标的测定

株高、根长采用皮尺测量；茎粗用游标卡尺测量；取小麦幼苗期植株(去根)，用电子天平称量鲜重，然后烘干称干重。

超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定采用NBT光化还原法，单位用U/mg表示[18]；CAT活性测定采用紫外吸收法，单位用U/(mg·min)表示[18]；POD活力的测定采用愈创木酚法测定，单位用U/mg表示[18]；采用丙酮和95%乙醇(V∶V为1∶1)浸提分光光度法测定叶绿素含量，单位为mg/g[19]；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，单位为μmol/g[19]。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 氧乐果对小麦幼苗生长的影响

氧乐果单独处理小麦，对小麦的生长具显著的抑制作用(表1)，与对照相比，小麦幼苗根长、株高、茎粗、干重和鲜重分别降低了26.46%、12.38%、14.75%、26.32%和50.0%。本试验结果说明氧乐果对小麦幼苗有毒害作用，抑制小麦幼苗的生长。

表1氧乐果对小麦幼苗生长的影响1)

Table1Effectsofomethoateonthegrowthofwheatseedlings

处理Treatment根长/cmRootlength株高/cmPlantheight茎粗/cmStemdiameter鲜重/gFreshweight干重/gDryweight1/2Hoagland营养液+10g/L氧乐果1/2Hoaglandsolution+10g/Lomethoate(19．71±0．40)b(15．71±0．19)b(0．52±0．03)b(0．14±0．001)b(0．01±0．001)b1/2Hoagland营养液(对照)1/2Hoaglandsolution(CK)(26．80±0．60)a(17．93±0．44)a(0．61±0．05)a(0．19±0．001)a(0．02±0．002)a

1) 表中数据为平均值±标准误，同列数据不同字母表示在0.05水平差异显著。
Data in the table are mean±SE. Different lowercase letters in the same column indicate significant different at 0.05 level.

2.2 复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗生长的影响

由图1、2可知，采用喷施法和灌根法施用复合菌剂PS21处理小麦幼苗，均能有效缓解氧乐果对小麦生长的抑制作用，缓解作用与复合菌剂浓度的升高呈正相关性，各处理间均存在显著差异。菌液浓度为108cfu/mL，小麦幼苗各生长指标达到最高，与氧乐果单独处理组相比，喷施法处理组小麦株高、茎粗、干重和鲜重分别提高了31.95%、21.15%、130.0%、45.18%，灌根法处理组小麦相应生长指标分别提高了60.98%、32.69%、180.0%、55.56%。采用不同方法施用复合菌剂对氧乐果毒害小麦的缓解能力不同，菌液为106～108cfu/mL时，灌根法处理组小麦幼苗株高、干重和鲜重比喷施法处理组相应值大，达到差异性显著水平(P<0.05)；当菌液浓度<107cfu/mL，喷施法处理组小麦茎粗和灌根法处理组相应值差异性不显著，菌液浓度为108cfu/mL时，两处理相应值存在显著差异(P<0.05)。复合菌剂和氧乐果复合处理小麦，氧乐果对小麦生长的抑制作用有所缓解，促进了小麦的生长。

图1 不同浓度复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗株高和茎粗的影响

图2 不同复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗鲜重和干重的影响

2.3 复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素是光合作用的主要色素，参与植物的光合作用，其含量反映了叶片生理状态。从图3可以看出，氧乐果单独处理组的小麦幼苗叶绿素含量下降，比对照组下降了35.49%。施用复合菌剂PS21后，小麦幼苗叶绿素含量随着复合菌剂浓度的增大而增加，复合菌剂各处理组极显著高于氧乐果单独处理组(P<0.01)，菌液浓度为108cfu/mL时，小麦幼苗叶绿素含量达到最高，喷施法和灌根法处理组分别比氧乐果单独处理组提高了108.94%、145.09%。复合菌剂不同施用方法对氧乐果毒害小麦幼苗的缓解程度不同，灌根法处理组中叶绿素含量比喷施法处理组中相应值大，且达显著差异水平(P<0.05)。由此可表明，复合菌剂缓解了氧乐果对小麦叶绿素合成的伤害，且随浓度的增加缓解作用增强。

图3 不同复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗叶绿素含量的影响

2.4 复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗抗氧化酶活性的影响

SOD、CAT和POD 3种酶具有清除植物体内活性氧自由基、维持细胞膜稳定性的功能。由图4可知，氧乐果单独处理小麦幼苗时，小麦叶片SOD、CAT和POD活性下降，与对照相比，分别下降83.01%、80.26%和70.16%，氧乐果显著抑制了3种酶的活性。施用复合菌剂PS21后，小麦幼苗SOD、CAT和POD活性随着复合菌剂浓度的升高而增加，且各处理间达到显著差异水平(P<0.05)，菌液浓度为108cfu/mL时，小麦幼苗抗氧化酶活性达到最高，与氧乐果单独处理组相比，喷施法处理组小麦幼苗SOD、CAT和POD活性分别提高了184.21%、320.0%、174.07%，灌根法处理组小麦相应酶活性分别提高了216.70%、380.0%、199.89%。由此表明，光合细菌可提高植物应激能力，缓解氧乐果对小麦造成的损伤。采用不同方法施用复合菌剂缓解氧乐果毒害小麦幼苗的程度不同，菌液为106～108cfu/mL时，灌根法处理组小麦幼苗SOD、CAT和POD活性比喷施法处理组相应值大，达到极显著差异水平(P<0.01)。

图4 不同浓度复合菌剂与氧乐果复合处理对小麦抗氧化酶活性的影响

2.5 复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的重要产物，其含量的高低是评定植物细胞膜受损害程度的指标之一。图5显示，氧乐果单独处理组小麦幼苗的MDA含量显著增加，比对照增加了476.37%。施用复合菌剂PS21后，小麦幼苗MDA含量随着复合菌剂浓度的增大而降低，菌液浓度为108cfu/mL时，小麦幼苗MDA含量达到最低，喷施法和灌根法处理组MDA含量分别比氧乐果单独处理组降低了43.93%、75.85%。复合菌剂不同施用方法缓解氧乐果对细胞膜破坏的程度不同，喷施法处理组中MDA含量比灌根法处理组中相应值大，且达差异显著水平(P<0.01)。由此表明，复合菌剂缓解了氧乐果对小麦细胞的伤害，且随浓度的增加缓解作用增强。

图5 复合菌剂PS21与氧乐果复合处理对小麦幼苗MDA含量的影响

3 讨论与结论

过量的氧乐果对小麦幼苗将造成伤害，伤害机理为在氧乐果胁迫下，小麦体内自由基的积累会引起MDA含量的升高，膜脂过氧化，破坏了小麦体内正常的代谢动态平衡，损伤小麦细胞[6-7]。SOD、CAT和POD是植物抗氧化酶系中的主要酶类[5-8]，能清除植物体内活性氧自由基，使植物细胞免受伤害。在正常及逆境情况下，SOD、CAT和POD会升高，及时清除植物体内活性氧，提高植物的抗逆性，但生物的抗性是有限的，如果胁迫超过阈值，自由基不能及时清除，同时会使SOD、CAT和POD3种酶的活性下降，MDA含量的升高，从而使细胞受到损伤。在本试验中，与对照相比，浓度10 g/L的氧乐果显著抑制了小麦幼苗SOD、CAT和POD活性，MDA含量增加，细胞膜受损害程度较大，导致小麦幼苗生长受到抑制，各生长指标明显降低。

光合细菌能降解有机物，并产生泛酸、氨基酸、辅酶Q、5-氨基乙酰丙酸(ALA)卟啉类化合物、植物激素(如IAA,GA3、乙烯、细胞分裂素)和抗病毒因子等大量生物活性物质[20-21]。这些物质能激发植物细胞的活性，提高植物的光合作用效率和SOD、CAT和POD活性，从而使植物的抗逆性增强。本试验研究结果表明，复合光合细菌菌剂能提高小麦幼苗SOD、CAT和POD活性，降低MDA含量，小麦细胞内活性氧被及时清除，细胞受到了保护，与氧乐果单独处理组相比，小麦的各生长指标有明显提高，促进了小麦的生长。这与一些学者的研究结果一致，光合细菌能提高逆境下植物抗氧化酶活性，促进作物幼苗的生长[15-16]。但上述关于光合细菌的研究多采用单一菌剂，需菌量大，对逆境抑制植物生长的缓解作用较低,本试验采用复合菌剂处理氧乐果胁迫下小麦幼苗，复合菌剂具有协同作用，通过分泌生理活性物质，提高SOD、CAT和POD活性，灌根法处理组小麦相应酶活性可达到最高，与氧乐果单独处理组相比，分别提高了216.70%、380.0%、199.89%。复合菌剂的不同施用方法对逆境毒害植物的缓解作用及对植物的促生效果存在差异[22-23]。本研究发现，相应浓度复合菌剂处理下，灌根法对氧乐果毒性缓解作用较强，并且对小麦的促生效果较好。分析其原因可能是因为(1)复合菌剂能降解及转化氧乐果，解除氧乐果对植物的毒害；(2)复合菌剂产生促生因子，促进小麦的生长。

光合细菌已被证明可以促进植物生长，防治病虫害，但光合细菌菌剂作为外源微生物，应用效果与微生物浓度以及施用方法有关，菌液浓度过大，对植物生长有抑制作用。采用不同的菌剂施用方法，对植物的促生效果也不同。因此，对复合菌剂浓度及施用方法的筛选是必要的。本研究表明，采用灌根法，菌液浓度为108cfu/mL时，缓解或解除氧乐果对小麦生长的抑制作用最强。

综上所述，浓度为106～108cfu/mL的复合菌剂与氧乐果复合处理后，均可产生不同程度的缓解或解除氧乐果对小麦生长的抑制作用，菌液浓度108cfu/mL，缓解作用最明显；灌根法和喷施法相比，相应浓度下，灌根法处理组对氧乐果毒害有较强的缓解作用。

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EffectsofcompoundbacteriaPS21onseedlinggrowthandantioxidantenzymesinwheatunderomethoatestress

Ge Honglian, Liu Zhonghua

(SchoolofLifeScienceandAgronomy,ZhoukouNormalUniversity,Zhoukou466001,China)

The seedlings of wheat were cultured in liquid media containing omethoate, or the combination of omethoate and compound bacteria PS21. The seedling growth and antioxidant enzyme activities were examined for each medium, in order to explore the influence of compound bacteria PS21 on seedling growth and antioxidant enzymes activities in wheat under the stress of omethoate. The results showed that the different concentrations of compound bacteria could alleviate the omethoate toxicity in wheat plants to various degrees, and there was a positive correlation between alleviative effect and compound bacteria PS21 concentration. Under 108cfu/mL PS21 treatment, the omethoate stress suffered by wheat seedlings could be obviously alleviated. Compared to sole omethoate treatment, compound bacteria PS21 could remarkably increase plant height, stem diameter, dry weight, wet weight, and the contents of chlorophyll. With increasing concentration of compound bacteria PS21, antioxidant enzyme activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) increased to various degrees, whereas malondialdehyde (MDA) contents of seedling leaves decreased. The relieving effects were different among two application methods of compound bacteria PS21. Root-irrigating method significantly alleviated omethoate toxicity in wheat plants.

compound bacteria PS21; omethoate; seedling growth; wheat; antioxidant enzyme system

2013-11-06

：2014-05-08

河南省科技计划项目(132300410032)；河南省教育厅科学技术重点项目(13B18027)

S 482.33

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.010

* 通信作者 E-mail：gehonglian2003@126.com