Real-time PCR分析锰对甘草β-AS基因表达的影响

马生军，王文全，朱金芳，侯俊玲

(1.北京中医药大学中药学院,北京 100102；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052；3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193；4.中药材规范化生产教育部工程研究中心,北京 100102)

锰(Mn)是植物生长发育必需的微量元素之一，作为多种酶的活化剂和重要的氧化还原剂的研究还较薄弱，在已筛选的数量有限的编码酶基因中，部分生物学功能已得到确认[1]。近年来，利用T-DNA插入突变和酵母菌功能互补实验在植物中鉴定了多种转运蛋白基因，这些转运蛋白部分参与锰的跨膜运输[2]。进一步分析表明，转运蛋白在细胞水平上参与锰向细胞内的转运和向不同细胞器(叶绿体和线粒体等)的释放，以及活性离子在内膜区域(液泡、高尔基体和内质网等)的屏蔽作用，而在整个植株水平上参与植物对锰的吸收、长距离运输和在地上部的累积过程[3]。荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，Real-time PCR)技术是近年来发展起来的一种新的核酸微量技术，它实现了RT-PCR反应从定性到定量的飞跃。利用Real-time PCR手段分析不同浓度锰处理下甘草β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因的表达丰度，对于明确该基因的表达受锰调控的影响具有重要意义。

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是中药中常用的大宗药材之一，具有补脾益气，祛痰止咳，调和诸药等功效，其主要次生代谢产物甘草酸是经过多个生物合成步骤才得以形成的，而每个步骤均受到酶的调控[4-5]。β-AS基因是甘草酸生物合成途径中的重要基因,与甘草酸生物合成具有密切关系[6]。甘草酸是以异戊二烯为基本结构单元构建的三萜类化合物，β-AS催化2，3-氧化鲨烯环化成β-香树酯醇，是控制形成甘草酸类化合物(齐墩果烷型)或是白桦酯酸类化合物(羽扇豆烷型)的分支点，是甘草酸生物合成的关键酶[5]。最新的研究表明根施一定浓度的锰能显著增加甘草药材中甘草酸含量[7]。因此，本文以β-AS基因作为研究对象，比较其在不同浓度锰处理下在甘草G.uralensis根部的表达情况，为揭示该基因对甘草酸含量的影响机制奠定基础，并为进一步提高栽培甘草质量、实现甘草资源的可持续利用提供理论支持。

1 材料

1.1 植物 以一年生甘草移栽苗为试验材料，该苗来自内蒙古赤峰，经北京中医药大学王文全教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

1.2 试剂 TRIZOL试剂盒购自美国Invtrogen公司；DNaseⅠ和RNase inhibitor购自美国Fermentas(MBI)公司；DL DNA-2000 Marker，dNTP mixture (each 10 mM)，Oligo dT primer，5×M-MLV Buffer，M-MLV(Rnase H-)，LA Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；Eva-green购于美国Biotium公司;异丙醇、氯仿、乙醇等试剂均为分析纯，购于北京化学试剂公司。

1.3 仪器 centrifuge(MICRO 17TR)离心机(韩国Hanil公司)；mixer vortex(Voltex-Genie2)漩涡混合器(美国SI公司)；system electrophoresis Mupid(Mupid 2plus)电泳槽(日本Takara公司)；image system(EUV-LDUV)凝胶成像系统(韩国Biotech公司)；ASP-2680超微量分光光度计(美国ACTGene公司)；2720型PCR仪(美国ABI公司)；Chromo4荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)；Freezer Big(DW-40L262)冰箱(青岛海尔公司)；超净工作台(苏州净化公司)；2.5、10、100、200/1 000μL移液器(德国Eppendorf公司)；Balance(BT-214)天平(美国Denver公司)。

2 方法

2.1 植物材料的处理 试验在北京中医药大学药用植物园内进行,2013年4月下旬将生长状况基本保持一致的一年生甘草苗移栽于花盆中,盆高35 cm，盆口直径35 cm，盆底直径25 cm，栽培基质为蛭石∶珍珠岩∶河沙=5∶1∶1，每盆20株，然后将花盆埋入土中。每周向花盆中浇灌Hoagland营养液以提供植物所需的养分，待植株生长正常时，进行不同浓度的锰处理试验，分别设置0(CK)，1.81，18.1，36.2和54.3 mg/L5个锰浓度，其中1.81 mg/L为Hoagland全营养液中锰浓度，并在此质量浓度基础上设置10倍，20倍和30倍的锰水平以及未施锰的对照(CK)处理，每样品重复4次。处理90 d后取样。

2.2 甘草根总RNA的提取 称取0.2 g甘草主根于液氮中研磨，参照Invitrogen公司TRIZOL试剂盒说明提取甘草总RNA，通过1.0%琼脂糖电泳检测RNA的质量并拍照，同时利用超微量分光光度计检测各处理OD值。

2.3 逆转录合成cDNA第一链 DNaseⅠ处理去除基因组DNA污染，逆转录过程如下：首先在200 μL离心管中配制如下(体系一)：模板RNA 0.5 μg，10 mmol/LdNTP Mixture 1.0 μL，50 μmol/LOligo dT 1.0 μL，补足RNase free dH2O总量至10 μL，65 ℃反应5 min，置于冰上2 min，瞬时离心。然后在以上体系中加入总量为20 μL的如下混合反应液(体系二):模板RNA(引物的变性溶液)10.0 μL，5×M-MLVBuffer 4.0 μL，200 U/μL M-MLV(RNase H-)1.0 μL，40 U/μL RNase inhibitor 0.5 μL，RNase free dH2O 4.5 μL。30 ℃保温10 min。42 ℃保温1 h，70 ℃ 15 min，之后立即置于冰上冷却。产物于-20 ℃保存备用或立即进行PCR扩增。

2.4 引物的设计与合成 参考相关内参基因及甘草文献，选择18S rRNA作为内标准基因，用于甘草的定量检测。内参18S基因的引物和待检测基因β-AS扩增片段大小均在300 bp以内，可以很好的起到内参的作用。

依据GenBank数据库上提供的甘草18S和β-AS基因序列，找出序列保守区，用primer premier 5.0 软件分段设计引物(表1)，引物由北京中美泰和生物工程有限公司合成。

表1 18S和β-AS基因的PCR扩增引物

2.5 实时定量PCR(Real-timePCR)扩增

2.5.1 PCR反应体系 20.0 μL反应体系中，内含10×PCR buffer(含镁离子)2.0 μL;2.5 mmol/LdNTP 3.2 μL；5 μmol/LForward primer 1.0 μL；5 μmol/LReverse primer 1.0 μL；1 U/LLA TaqDNA聚合酶0.2 μL；cDNA模板5.0 μL；ddH2O 7.6 μL。

2.5.2 PCR反应程序 在PCR仪中，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s，40个循环。产物于4 ℃保存备用或立即进行PCR凝胶电泳。

2.5.3 Real-time PCR扩增20.0 μL反应体系中，内含10×PCR buffer(含镁离子)2.0 μL；2.5 mmol/LdNTP 3.2 μL；5 μmol/LForward primer 1.0 μL；5 μmol/LReverse primer 1.0 μL；1 U/LLA TaqDNA聚合酶 0.2 μL；cDNA模板5.0 μL；1×1.25 μL；ddH2O 6.05 μL。在Real-timePCR仪中，95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s，40个循环。

2.6 琼脂糖凝胶电泳 反应结束后取4.0 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上进一步检测PCR扩增情况。120 V电压，电泳20～30 min。凝胶成像系统下查看，并拍照。

2.7 β-AS基因的Real time PCR分析 将Real-time PCR仪所得的样品Ct值，利用2-△△Ct方法转化为基因相对表达量值。应用Excel软件进行数据录入及表的绘制，采用SPSS 16.0软件进行统计与One-way ANOVA方差分析，并用Duncan检验法进行多重比较。

3 结果与分析

3.1 不同浓度锰处理甘草总RNA提取 通过琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度锰处理甘草总RNA(图1)：甘草根总RNA条带清晰完整, 亮度均匀，点样孔周围无污染, 并且没有明显拖尾现象，分光光度计检测，D260/D280均在1.8～2.0之间，D260/D230大于2.0，说明采用该方法提取的RNA纯度较高、质量较好,可用于后续实验。

图1 不同锰处理甘草总RNA琼脂糖凝胶电泳图

3.2 扩增体系的验证 PCR扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，均产生与预期大小一致的扩增条带，无引物二聚体及非特异性扩增(图2)。经Real-time PCR验证2个基因的熔解曲线均显示明显的单一峰，说明所用引物的特异性较好(图3)。

3.3 不同浓度锰处理甘草18S和β-AS基因Ct值比较 以不同浓度锰处理的盆栽甘草DNA为模板进行Real-time PCR，18S和β-AS基因的Ct值见表2。由表2可知，内参基因18S在不同浓度锰处理的甘草根部定量反应的Ct值分别在16.38～18.82之间，与对照(0 mg/L)相比各处理间差异极显著(P<0.01)，但1.81 mg/L和18.1 mg/L处理间差异不显著(P>0.05)；目的基因β-AS在不同浓度锰处理的甘草根部定量反应的Ct值在20.16～24.24变化，与对照(0 mg/L)相比各处理间差异极显著(P<0.01)，且各处理间差异亦有统计学意义(P<0.01)。18 S和β-AS基因均在18.1 mg/L 锰处理浓度时Ct值最小分别为16.30,20.22，说明该浓度处理条件下这2个基因的循环阈值最低(见图4),表达丰度最高。

图2 18S和β-AS基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

图3 18 S和β-AS基因的溶解曲线

基因Ct值0 mg/L1.81 mg/L18.1 mg/L36.2 mg/L54.3 mg/L18S基因18.76+0.06aA16.39+0.01dD16.30+0.08dD17.08+0.11cC17.29+0.08bBβ-AS基因24.16+0.08aA20.51+0.06dD20.22+0.06eE21.55+0.07cC22.73+0.12bB

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

图4 不同浓度锰处理甘草18S和β-AS基因扩增曲线

3.4 不同浓度锰处理甘草β-AS基因相对表达量的分析 不同浓度锰处理的盆栽甘草Real-time PCR扩增后β-AS基因相对表达量的分析结果见表3。由表3可知，随着锰处理浓度的增加β-AS基因在甘草根部的相对表达量亦逐渐增加，而后随着锰处理浓度的增加又开始逐渐下降。18.1 mg/L锰处理浓度时β-AS基因的相对表达量达最大值为12.43，分别是对照(0,36.2和54.3 mg/L处理的2.79，1.47，2.88倍，且与这3个浓度锰处理时β-AS基因的相对表达量差异极显著(P<0.01)，但与1.81 mg/L锰处理在0.05水平差异显著(P<0.05)而0.01水平差异不显著(P>0.01)。这一结果说明,锰处理浓度在18.1 mg/L时对甘草β-AS基因在根部的积累表达最有效，与Ct值结果相一致。

表3 不同浓度锰处理甘草β-AS基因相对表达量

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

4 讨论

基因表达量作为现代分子生物学的基础之一，从根本上阐释了基因在一定环境条件下分子和遗传的机理[8]。目前，已有许多技术用于评价基因的表达水平，如Northernblot、RNA protection assay、半定量RT-PCR等。尽管他们各有优点，但是与Real-time PCR相比，其准确性与重复性都略显不足，而且这些方法操作繁琐，不利于开展大规模的检测、检查[9-10]。用Real-timePCR技术对β-AS基因进行定量测定，克服了上述缺点,是在分子水平对甘草β-AS基因表达量进行检测的一大进步。本实验利用2-△△Ct相对定量的方法对不同浓度锰处理下的盆栽甘草根部β-AS基因相对表达量的检测，结果表明β-AS基因的表达丰度与Ct值(cycle threshold，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)高度吻合，说明PCR扩增过程中β-AS基因的循环阈值越低其扩增效率越高，在植物体内表达的量也越丰富，因此也更容易被检测到。

有关受金属元素的影响植物体内蛋白量会增加,已有多个报道。Tsneg等研究发现，金属和温度胁迫均能增加水稻小分子量(16～20 kDa)热激蛋白(HSPS)的mRNA水平。除热激蛋白(HSPS)外，金属元素还能诱导Ubiquitin、DnaJ-like蛋白、几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶、富含脯氨酸细胞壁蛋白(PRP)、富含甘氨酸细胞壁蛋白(GRP)和病原相关蛋白(PR)等基因的表达[11]。ZIP基因家族可以编码金属转运蛋白,通过运输锰来增强耐性；在高浓度锰供应下，MTM1作为MCF家族中的一员也能运输锰,对于线粒体中SOD2(含锰元素)的合成起着重要作用[2]。由于锰是植物生长的必须元素，在细胞水平上广泛存在于植物的液泡、叶绿体、线粒体、高尔基体及内质网等各个器官[11]。因此，研究锰对甘草中甘草酸合成的直接前提物质β-香树脂醇合成起催化作用的关键酶β-AS的影响显得尤为重要。实验发现，随着锰处理浓度的增加甘草β-AS基因的相对表达量也显著增加(P<0.05)，当达到一定浓度(18.1 mg/L)时开始下降，表明甘草β-AS基因的表达与金属元素锰含量的高低有明显的关系，这种联系的产生究其机理还有待进一步研究。

[1]郑鹤龄.微量元素营养诊断[M].天津:天津科技翻译出版公司,2010.

[2]任立民,刘鹏.锰毒及植物耐性机理研究进展[J].生态学报,2007,27(1):357-367.

[3]张玉秀,李林峰,柴团耀,等.锰对植物毒害及植物耐锰机理研究进展[J].植物学报,2010,45(4):506-520.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[5]刘颖,刘春生.甘草β-AS基因时空表达模式研究[J].中药材,2012,35(4):528-531.

[6]刘颖,刘东吉,刘春生,等.基于HMGR、SQS1、β-AS基因CNVs的甘草道地性机制研究[J].药学学报,2012,47(2):250.

[7]Wang D,Wan C Y,Wang W Q,et al.Effects of Manganese Deficiency on Growth and Contents of Active Constituents of Glycyrrhiza uralensis Fisch.[J].Communications in Soil Science and Plant Analysis,2012,43(17):2218-2227.

[8]ZHANG Gang,ZHAO Mingming,SONG Chao,et al.Characterization of reference genes for quantitative real-time PCR analysis in various tissues of Anoectochilus roxburghii[J].Molecular Biology Reports,2012,39(5):5905-5912.

[9]陆志成,蔡刚,沈茜.实时RT-PCR检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的表达[J].检验医学,2005,20(1):59-62.

[10]刘颖,刘东吉,刘春生.甘草HMGR,SQS1,β-AS合酶基因CNVs检测体系的建立[J].中国中药杂志,2012,37(3):283-287.

[11]徐向华.超积累植物商陆吸收累积锰机理研究[D].杭州:浙江大学,2006:19.