林蛙皮中胶原蛋白的提取工艺研究

2014-08-09 01:18屈巧凤姜大成
吉林中医药 2014年12期
关键词:皮中林蛙羟脯氨酸

屈巧凤,姜大成

(长春中医药大学,长春 130117)

林蛙皮含有胶原蛋白、透明质酸、多肽、金属元素等多种化学成分[1-4]。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质,占体内蛋白质总量的25%~30%,相当于体质量的6%[5-6]。胶原蛋白因其独特的结构和功能,被广泛的应用于食品、化妆品、医学、造纸等领域[7-11]。本文从药材粉碎度、加水量、酶的种类3个方面探讨从林蛙皮中提取胶原蛋白的影响因素及优化条件。

1 实验材料

取中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)腹部的皮,干燥,将其粉碎,过60目筛,备用。微型植物试样粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂)、TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)、ZK-82B型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)、HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、柠檬酸(天津市福晨化学试剂厂)、柠檬酸钠(天津市福晨化学试剂厂)、对二甲氨基苯甲醛(天津市光复精细化工研究所)、冰醋酸(北京化工厂)、L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline,批号111578-200201,中国药品生物制品检定所)。

2 实验方法

2.1 林蛙皮中胶原蛋白的提取方法 将上述粉碎好的林蛙皮粉末称量5 g,加入适量的蒸馏水,以浸没为准,再分别加入适量的胰蛋白酶和柠檬酸,在30 ℃下提取48 h,过滤,收集滤液,将滤液离心,3 000 r/min,离心15 min,收集上清液,冷冻干燥。即得胶原蛋白粗提物[12]。

2.2 胶原蛋白的含量测定方法 称量2 g胶原蛋白粗提物,加入50 mL 6 mol/L的盐酸,120 ℃消解8 h,放冷,挥去盐酸,过滤,蒸馏水定容至100 mL,取1.5 mL,以1 mol/L的NaOH调整PH到6.0,定容至25 mL,吸取1 mL,加入1 mL蒸馏水、1 mL柠檬酸缓冲溶液和1 mL氯胺T,25 ℃保温氧化10 min,然后加入3.5 mol/L高氯酸溶液1 mL,室温放置10 min,加入对二甲氨基苯甲醛试剂1 mL,震荡均匀(其低温易结晶,使用前应加热),在65 ℃水浴中保温10 min,使其显色,于558 nm下测其吸光度[13-14]。羟脯氨酸与胶原蛋白质量换算公式如下:M=C×稀释倍数×总体积×换算系数,式中M—林蛙皮中胶原蛋白的含量;C—消解液中羟脯氨酸的质量浓度;换算系数—10(两栖类动物胶原蛋白中羟脯氨酸的大体含量)[15]。

3 结果

3.1 药材粉碎度的考察 由于林蛙皮较为坚韧并且质地较轻,胶原蛋白网络密集,直接水解效果较差,将林蛙皮进行适当的粉碎可以增加林蛙皮的表面面积,提高水解效果,具体操作如下:取林蛙皮100 g,用粉碎机进行适度粉碎,分别筛取粒径为2 mm以下粉末、5 mm以下粉末、10 mm以下粉末各20 g,分别加适量的蒸馏水,以完全浸没为准,加0.05 g胰蛋白酶,10.08 g柠檬酸,37 ℃时提取48 h,过滤,将滤液冷冻干燥,测定其中胶原蛋白的提取量。通过比较发现,林蛙皮的粉碎度越大则胶原蛋白的含量越高,所以林蛙皮在提取时必须要粉碎,考虑到粒径在2 mm以下比较难控制,并且粉碎过程中产生细粉较多,所以确定林蛙皮的粉碎度控制在5 mm以下即可,见表1。

表1 粉碎度、加水量、酶的种类对胶原蛋白含量的影响

3.2 加水量的考察 林蛙皮适度粉碎,取5 mm以下粉末3份,每份20 g,分别加入50、60、70 mL蒸馏水,0.05 g胰蛋白酶,10.08 g柠檬酸,37 ℃时提取48 h,过滤,将滤液冷冻,测定其中胶原蛋白的提取量。通过试验发现,加入60 mL的水时胶原蛋白的含量最高,因此,选择加入60 mL的水,结果见表2。

表2 优选胶原蛋白提取工艺条件正交试验因素水平表

3.3 酶的种类考察 林蛙皮适度粉碎,取5 mm以下的粉末3分,每分20 g,分别加入60 mL蒸馏水,0.05 g胃蛋白酶、0.05 g胰蛋白酶、0.05 g木瓜蛋白酶,10.08 g柠檬酸,37 ℃时提取48 h ,过滤,将滤液冷冻干燥,测定其中胶原蛋白的提取量。结果显示当加入等量的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶时,胰蛋白酶能够提取出更多的胶原蛋白,因此林蛙皮酶解时选用胰蛋白酶,结果见表3。

表3 胶原蛋白提取工艺条件正交试验结果表

3.4 正交实验优化 见表4。

表4 胶原蛋白提取工艺正交试验结果方差分析表

按照L9(34)正交表进行试验,称取林蛙皮,粉碎成5 mm以下,共9份,每份5 g,按照表3进行试验,以胶原蛋白的含量(方法见“1.2.2胶原蛋白的含量测定”)为考核指标。根据直观分析和方差分析的结果:提取时间对试验结果影响最显著,其次为加入的柠檬酸的量,对胶原蛋白的提取影响最小的是加入的胰蛋白酶的含量,由此可见,各因素对试验结果影响的重要性依次为A>D>B>C,根据各个因素对指标的影响程度,确定胶原蛋白提取的最优工艺为:A3B3C1D2,即加水量是60 mL,提取时间是72 h,提取温度是37 ℃,加胰蛋白酶的量是1%(0.05 g),加柠檬酸的量是0.8 mol/L。

4 结论

综上确定了林蛙皮中胶原蛋白的最佳提取工艺:将中国林蛙的腹部皮干燥,粉碎,过60目筛,取5 g,加入60 mL水,再分别加入1%的胰蛋白酶和0.8 mol/L的柠檬酸,在37 ℃下提取72 h,过滤,收集滤液,将滤液离心,3 000 r/min,离心15 min,收集上清液,冷冻干燥。即得胶原蛋白粗提物。在此优化条件下提取,胶原蛋白的提取率为67.09%。

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