基于主成分分析模式对不同产地梅花鹿茸HPLC指纹图谱研究

曹 越，田淋淋，李 航，张美双，宗 颖，刘 冬，张 辉*，孙佳明*

(1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，长春 130117)

鹿茸为鹿科动物梅花鹿CervusNipponTemminck或马鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。马鹿茸按产地分为东马鹿茸和西马鹿茸[1]。鹿茸是我国传统名贵中药之一，其含有的化学成分十分复杂，主要有蛋白质多肽类物质，还含有丰富的氨基酸，脂肪酸，微量元素等[2-4]。目前，由于我国市场上的鹿茸药材大部分来源于梅花鹿，导致大量的梅花鹿茸易混品与伪品混入了药材市场，所以建立全面、系统地控制梅花鹿茸品质的分析方法十分重要。HPLC指纹图谱技术是评价中药质量的一种快速简便的方法[5-10]。本实验采用梯度洗脱模式，建立了完整的梅花鹿茸药材HPLC指纹特征图谱分析，并基于主成分分析对梅花鹿茸和马鹿茸进行了模式识别，清晰地区分了梅花鹿茸和马鹿茸。为梅花鹿茸药材的品种鉴别与质量控制提供了可靠的依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪，配有四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chemistation化学工作站等。BP211D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯天平有限公司)。电热恒温水浴锅(江苏南通县通海电器厂)。

1.2 药材来源 10批梅花鹿茸样品来自于我国吉林省和辽宁省的不同养殖场,其中4批样品来自于吉林双阳(双阳01，双阳02，双阳03，双阳04)，2批来自于吉林东丰(东丰01，东丰02)，2批来自于吉林敖东(敖东01，敖东02)，2批来自于辽宁西丰(西丰01，西丰02)。7批东马鹿茸来自于我国东北的吉林省和辽宁省，4批来自于吉林双阳(双阳05，双阳06，双阳07，双阳08)，1批来自于吉林东丰(东丰03)，2批来自于辽宁西丰(西丰03，西丰04)。2批西马鹿茸来自于我国西北的新疆省(新疆01，新疆02)。所有的样品都得到了长春中医药大学张辉教授的鉴定。甲醇(色谱纯，美国TEDIA有限公司)；水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为TIANHE C18(4.6×250 mm，5 μm)。流速为0.3 mL/min，检测波长为260 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0～5 min(B：1%～2%)；5～10 min(B：2%～2%)；10～20 min(B：2%～4%)；20～40 min(B：4%～4%)；40～42 min(B：4%～55%)；42～55 min(B：55%～60%)；55～60 min(B：60%～100%)。

2.2 对照品溶液的制备 分别取尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷对照品适量，精密称定,各加水制成1 mg/mL的溶液。各取尿嘧啶溶液344 μL、次黄嘌呤溶液438 μL、尿苷溶液438 μL、肌苷溶液250 μL、鸟苷溶液374 μL、腺苷溶液156 μL于同一小瓶中，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液的制备 依次精确称取19分鹿茸粉末各1 g，加10 mL水煎煮1 h，然后12 000 r/min离心15 min，取1 mL上清液转移到已经依次用1 mL甲醇和1 mL水冲洗过的1 mL/100 mg C18固相萃取柱中，待加载完上清液后，用1 mL水洗脱固相萃取柱,洗脱液过0.45 μm滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取2.2项下的对照品溶液，按2.1项下的色谱条件，重复进样5次，进样量为5 μL，测定峰面积值,计算尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为0.38%、0.42%、0.35%、0.32%、0.33%、0.40%(n=5)。试验表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取梅花鹿茸粉末1 g，按2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件，分别于0、4、8、12、24 h进样1次，考察精密度。尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷的RSD分别为0.55%、0.58%、0.50%、0.52%、0.55%、0.58%(n=5)，结果供试品溶液中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷在24 h内峰面积无明显变化。

2.4.3 重复性试验 取梅花鹿茸样品5份，每份1g，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行含量测定，结果尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷平均质量分数分别为0.14，0.34，0.33，0.28，0.29，0.06 mg/g，RSD分别为2.5%、2.3%、2.6%、2.4%、2.8%、2.7%(n=5)，表明此法重复性良好。

2.4.4 回收率试验 取梅花鹿茸样品适量5分，每分0.5 g，分别准确加入尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷对照品0.14，0.34，0.33，0.28，0.29，0.06 g，按2.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱方法进行测定，计算回收率。尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷平均回收率分别为98.3%、97.5%、103.3%、97.3%、96.7%、102.2%；RSD分别为2.8%、2.7%、2.9%、2.8%、3.0%、3.3%(n=5)。试验表明加样回收率良好。

2.5 梅花鹿茸HPLC指纹图谱的构建

2.5.1 梅花鹿茸指纹图谱共有峰的确定 按2.3项下方法制备供试品溶液,在2.1项下色谱条件下，对10批不同产地梅花鹿茸药材进行测定分析,确定了10个共有峰。其中3号峰化学性质稳定，保留时间以及峰面积重复性良好,与其它相邻峰分离良好，因此选择3号峰为参照峰。

2.5.2 梅花鹿茸指纹图谱共有模式建立 采用国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版,通过色谱峰多点校正的方法对10批不同产地梅花鹿茸药材指纹图谱色谱峰进行自动匹配生成药材的色谱指纹图谱共有模式(中位数法)。实验结果见图1。

S1～S10分别是1～10号样品，R：对照图谱图1 10批梅花鹿茸样品HPLC指纹图谱叠加图

2.5.3 梅花鹿茸指纹图谱相似度评价 以10批不同产地梅花鹿茸生成的共有模式为对照,相似度分析。总体来说，10批梅花鹿茸药材的相似度较好，除敖东02的相似度低于0.8外，其余9批药材的相似度均大于0.9,说明只有敖东02的质量较差，其他各产地之间指纹图谱无明显差异，药材质量稳定可靠。

2.5.4 鹿茸药材指纹图谱的主成分分析 根据19批梅花鹿茸和马鹿茸供试品溶液的HPLC谱图给出的相关参数，比较各供试品的色谱图。采用SPSS(20.0版)数据处理软件进行PCA统计分析。19批鹿茸样品的PCA分析结果显示鹿茸样品被清晰地分成了3组，分别命名为组Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。10批梅花鹿茸样品聚集在组Ⅰ，7批东马鹿茸样品聚集在组Ⅱ，2批西马鹿茸样品聚集在组Ⅲ。同时，三组之间的距离也得到了清楚的分析，图中第二组和第三组相距较近，均与第一组距离较远。由此得出结论，聚集在同一组的鹿茸样品具有相似的化学成分分布，来源于相同起源的药用动物。以上结果表明指纹图谱是和物质的来源密切相关的，可以用来作为检测鹿茸品质的方法。

3 结论

鹿茸药材中含有多种化学成分，简单测定一个或几个有效成分的量已不能全面地反映药材的质量，因此建立全面，系统，特征性的指纹图谱，是质量评价和控制的有效方法。本文通过建立不同产地的10批梅花鹿茸药材的HPLC指纹图谱，确立了10个共有峰。并对19批梅花鹿茸药材和马鹿茸药材进行了模式识别，采用主成分分析方法清楚的将其分为3组,梅花鹿茸单独在一起，东马鹿茸和西马鹿茸离得比较近，但他们之间也能明显的分开。所建立的HPLC指纹图谱及主成分分析模式方法具有快速稳定的特点，能够对不同产地的梅花鹿茸药材进行质量评价，也为其他动物来源药材的品种鉴别与质量控制方法的研究提供参考。

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