24节气内乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构变化

薛 娟,张 涛,曾 军,李 萍,3,高小其,娄 恺,*

(1. 新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐 830091； 2. 石河子大学生命科学学院, 石河子 832000；3. 新疆大学生命科学与技术学院, 乌鲁木齐 830046； 4. 新疆维吾尔自治区地震局, 乌鲁木齐 830011)

24节气内乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构变化

薛 娟1,2,张 涛1,曾 军1,李 萍1,3,高小其4,娄 恺1,*

(1. 新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐 830091； 2. 石河子大学生命科学学院, 石河子 832000；3. 新疆大学生命科学与技术学院, 乌鲁木齐 830046； 4. 新疆维吾尔自治区地震局, 乌鲁木齐 830011)

为了解乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构及多样性在24节气内的变化,选取24节气当天采集泉水样品(计24份),利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术对其进行群落结构及多样性分析,并结合该泉地球水文化学指标进行典型相关性分析。结果表明:泉水细菌群落的香农指数(H)变化幅度较大(1.088—3.003),春季(立春至谷雨)样品呈现出明显的波动趋势,并在惊蛰时达到最低值(1.088),夏季(立夏至大暑)和秋季(立秋至霜降)样品在节气内出现类似的递增趋势,冬季(立冬至大寒)样品则保持在较低水平(≈1.761)；辛普森指数(D)和均匀度指数(E)在24节气内变化的差异不显著。24节气的泉水细菌群落组成主要有厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门及梭杆菌门,此外,还有少量隶属于蓝藻门、螺旋体门、异常球菌-栖热菌门、绿菌门、柔膜菌门和硝化螺菌门等的类群存在于某些特定的节气中；春夏季节革兰氏阴性菌为优势类群,秋冬季节,革兰氏阳性菌为优势类群；硫氧化菌类群(Acidithiobacillus、Thiothrix)和硫还原菌群落(Desulfobacter、Desulfoluna)的存在,与10号泉的含硫特性相关。通过对各项地球水文化学指标的分析显示,电导率、水汞、甲烷、硫化物在各节气的波动最为剧烈；乌鲁木齐10号泉水体细菌群落组成随24节气更替存在一定变化并与地球水文化学指标相关。

24节气；细菌群落结构；多样性；T-RFLP；乌鲁木齐10号泉

乌鲁木齐10号泉, 为国家基本水化一类台, 位于乌鲁木齐南部柳树沟—红雁池断裂带(E 87°37′, N 43°42′) 上。泉水硫化物气味强烈,pH值为7.7,全年水温为11.0 ℃左右,为HCO3-SO4-Cl-Na型弱碱性矿化水[1]。目前,该泉是新疆维吾尔自治区最重要的地下流体综合观测泉,也是中国新疆与哈萨克斯坦交换地下流体资料的监测泉点之一[2]。

目前对24节气的相关研究主要集中在植物物候[3- 6]、动物物候[7]及气候调查[8- 10]方面,对于微生物群落的物候变化,国内相关研究较少[11- 12]。在含硫冷泉微生物方面,Nancy[13]、Anita[14]、Susanne[15]及Christian[16]等人借助不同的手段分别对加拿大极地冷泉、密歇根州硫化泉、加拿大硫化物冷泉和德国冷泉进行了研究,结果发现:硫化物对维持微生物群落稳定有重要作用,含硫冷泉内细菌大部分属于变形菌门,硫化物氧化细菌、蓝细菌等为其主要的优势类群。而针对含硫冷泉水体微生物群落的物候变化的研究,尚未见相关文献报道。

对乌鲁木齐10号泉的研究主要集中于地震分析[17- 19]和水体微生物群落结构方面[20- 24],而水体细菌群落在24节气内的组成及结构上是否存在差异,群落变化是否存在物候现象及细菌群落与地球水文化学参数间的响应关系尚不清楚。本研究采用T-RFLP技术对乌鲁木齐10号泉水体细菌在24节气内群落结构组成及多样性的变化,以及与地球水文化学元素之间的关系进行了研究,以期通过研究,为后续的微生物映震提供细菌群落组成的背景参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集及预处理

2011年8月3日至2012年7月27日的1a周期内,于每节气当天采集泉水样品3 L,采样后4 h内低温运回实验室[25]。所有采集的泉水样品经0.22 um微孔滤膜过滤,再用10 mL GTE buffer进行洗脱,用于后续DNA提取。

1.2 泉水12项理化指标测定

对24节气时所采集的泉水样品中的氟(F-)、硫化物(HS-)、水汞(Hg)、氡(Rn)、氦(He)、氩(Ar)、氮(N2)、甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)、流量(Flow)、电导率(C)和气体总量(Gas)等12项水文化学参数进行测定[26],并利用基于GIS的地震分析预报系统(Mapsis 2.8.5)绘制理化参数波动折线图。

1.3 样品总DNA提取

泉水中微生物总DNA的提取参照Shaheen等的方法[27],并根据泉水样品自身的特点稍作改进。取800 μL GTE 洗脱液,加入溶菌酶(10 mg /mL)30 μL 至终浓度为10 mg /mL,37 ℃水浴2 h；加入蛋白酶K(20 mg /mL)10 μL 至终浓度为0. 2 mg /mL,20% 的SDS 17 μL和5 mol /L的NaCl 10 μL,53℃水浴2 h；等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1) 抽提,离心取上清,再加入2 /3体积的氯仿抽提,离心取上清,加入0. 6 倍的异丙醇,4 ℃过夜；离心弃上清,用预冷的70% 乙醇清洗1 次,倒置凉干；加入20 μL TE 缓冲液,-20 ℃保存。

1.4 16S rDNA 片段扩增

利用细菌通用引物8F(5′-FAM-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′)和926R(5′-CCGTCA ATTCCTTTR AGTTT-3′)[28](Sangon,上海)对细菌16S rDNA片段进行PCR扩增。扩增体系如下:预混Premix 15 μL,上下游引物各0.25 μL,10倍稀释的DNA模板0.5 μL,Taq polymerase 0.05 μL,加dd H2O至体系为30 μL。

PCR扩增采用降落PCR,程序为:预变性95 ℃ 6 min, 95 ℃ 45 s,61 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s,扩增10个循环,每个循环递减0.5 ℃；95 ℃ 45 s, 56 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s,扩增20个循环,72 ℃延伸10 min,共计30个循环。 以无菌水为空白作为阴性对照。扩增结束后,产物用1%的琼脂糖凝胶进行含量及特异性检测。

1.5 细菌T-RFLP分析

利用HinfⅠ(Takara,大连)和MspⅠ(Takara,大连)两种限制性内切酶对PCR产物进行酶切,酶切体系根据说明书略作调整。HinfⅠ和MspⅠ酶切条件为37 ℃酶切10 h,酶切完毕后65 ℃水浴20 min终止反应。酶切产物利用2.5%的琼脂糖凝胶进行酶切效果检测。酶切产物遮光送上海基康生物技术有限公司检测,使用ABI 3730测序仪扫描,用Peak Scanner Software V1.0分析结果。

1.6 数据统计分析

选择末端限制性片段大小在50—900 bp之间,荧光强度大于50 FU且目的片段的峰面积比大于总峰面积0.5%(小于0.5%被认为是噪音)的片段进行多样性分析。分别计算各样品的香农指数(Shannon-Weiner indexH)、辛普森指数(Simpson indexD)和均匀度指数(Evenness indexE)[29]。利用Mica PAT+在线数据库(http://mica.ibest.uidaho.edu/)比对分析各T-RFs片段所代表的细菌种属,并将峰面积比大于4%的种属确定为优势类群[30]。分别对HinfⅠ和MspⅠ酶切片段进行比对,挑出共有种属,确定为该环境条件下所拥有的细菌群落。选用SPSS18.0进行样品系统聚类分析；借助CANOCO软件,分析泉水细菌群落组成与12项水文化学参数之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 泉水理化指标波动式变化

理化指标分析显示,在24节气内,各项指标均围绕背景值呈现出不同程度的上下波动(图1),其中,氮、氡、氟、流量和气体总量的波动较为平缓,氩、二氧化碳、甲烷、氦等4项参数出现了低于背景值的波动,硫化物、水汞和电导率等指标则出现了显著高于背景值的明显波动。

2.2 T-RFLP图谱及多样性分析

共获得T-RFLP指纹图谱48个,根据HinfⅠ和MspⅠ酶切T-RFLP图谱(图2)中T-RFs数目及相对峰高和峰面积值,分别计算了24个样品香农指数(H),辛普森指数(D)、均匀度指数(E)(图3)。结果显示,MspⅠ酶切样品微生物多样性高于HinfⅠ酶切,故后续分析采用MspⅠ酶切结果。

各项指数中,香农指数(H)变化幅度较大(1.088—3.003),春季(立春至谷雨)样品呈现出明显的波动趋势,并在惊蛰时达到最低值(1.088),夏季(立夏至大暑)和秋季(立秋至霜降)样品在节气内呈现类似的递增趋势,冬季(立冬至大寒)样品则保持在较低水平(≈1.761),且夏季样品的香农指数明显高于冬季。此外,辛普森指数(D)和均匀度指数变化较为平缓(E)。惊蛰时期样品的三项指数均最低。

2.3 样品聚类分析

对24节气样品进行质心法聚类分析显示(图4):芒种、大暑、处暑与小满等夏季样品,霜降、冬至、立秋与寒露等秋季样品,小寒、立春、清明、谷雨、惊蛰与春分等春季样品分别聚为一支；夏至与小暑、大雪与小雪、白露与秋分、清明与谷雨、惊蛰与春分等相邻节气聚为一支；芒种与大暑、处暑与小满、立秋与寒露、小寒与立春等相距较近的节气聚在一起。

图2 部分样品的T-RFLP酶切图谱Fig.2 parts of the sample T-RFLP restriction map

图3 Msp Ⅰ 酶切各项指数的变化Fig.3 the index variation by Msp Ⅰ digeste

图4 24节气乌鲁木齐10号泉细菌群落聚类图(1—24为采样日期)Fig.4 Dendrogram of the hierarchical clustering analysis of bacterial community in Urumqi No.10 Spring durning 24 solar terms(1—24 are sampling date)

2.4 24节气内细菌群落组成

经Mica数据库比对(表1,表2),24节气内所有细菌群落主要隶属于11个门,其中,放线菌门,拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和变形菌门的含量较高,占总体的75%以上。以上5门按其含量作折线图(图5),拟杆菌门和变形菌门在24节气内呈现出较为一致的含量波动；秋冬季节,变形菌门在群落中的含量最高,春夏季节,拟杆菌门在群落中的含量最高；秋冬季节各节气中放线菌门和其他类群与厚壁菌门呈现出相似的波动规律；春夏季节内的各节气又与拟杆菌门呈现出相似的波动规律；24节气中厚壁菌门含量的波动始终与拟杆菌门等呈现出相反的趋势,即：拟杆菌门含量最高时,厚壁菌门含量最低。

进一步分析各片段所代表的细菌类群,优势类群包括放线菌门的Arthrobacter、Corynebacterium、Frankia、Nocardioides和Streptomyces代表片段为130 bp和165 bp；拟杆菌门的Flavobacterium和Flexibacter,代表片段为84 bp和93 bp,厚壁菌门的Bacillus、Clostridium、Eubacterium和Paenibacillus代表片段为130 bp、165 bp、270 bp和485 bp；变形菌门的Acidithiobacillus、Acidiphilium、Caulobacter和Thiothrix代表片段有130 bp和165 bp；梭杆菌门的Leptotrichia,代表片段为165 bp；以及普遍存在于大部分样品中的暂定名类群(Candidatus),他们的代表片段为130 bp和165 bp。

特殊类群指仅在某些特定季节或节气中出现,且含量较少的类群,包括放线菌门的Microbacterium和Mycobacterium,代表片段为84 bp和165 bp；拟杆菌门的Capnocytophaga、Cytophaga和Microscilla,代表片段为84 bp和93 bp；变形菌门的Achromatium、Acidiphilium、Azoarcus、Azospirillum、Desulfatiferula、

Desulfobacter、Desulfofrigus和Stenotrophomonas,代表片段有84 bp、130 bp、165 bp、441 bp和455 bp；异常球菌-栖热菌门的Deinococcus,代表片段为270bp；蓝藻门的Synechococcus和Cylindrospermopsis,代表片段为130 bp和148 bp；螺旋体门的Treponema,代表片段为305 bp,硝化螺菌门的Leptospirillum,代表片段为80 bp；绿菌门的绿菌科某属和Prosthecochloris,代表片段为127 bp以及柔膜菌门的Phytoplasma,代表片段为212 bp。

2.5 细菌群落与12项水文化学参数的CCA分析

24节气样品基于T-RFs片段大小(图6-A)和细菌门含量(图6-B)与12项水文化学参数的CCA分析显示,电导率、甲烷、流量和氡等对细菌群落的分布影响较大。两种排序方式均显示群落组成有明显的聚集现象,主要可以分为两类。第一类：春夏季节内节气为主的细菌群落组成与氟、氡等具有较高的相关性；第二类：秋冬季节内节气为主的细菌群落组成与电导率等具有较高的相关性。其中,甲烷对秋季各节气细菌群落的影响较为显著。

通过对样品群落多样性与泉水理化参数的CCA分析发现(图6-C),24节气泉水细菌群落多样性与环境因子存在明显相关性。其中,氡、甲烷、流量、硫化物、电导率等因子对群落多样性的影响较大,均匀度指数(E)受环境影响相对较小,香农指数(H)与二氧化碳的含量变化呈显著正相关,辛普森指数(D)与流量、甲烷及电导率呈显著正相关,与氡呈显著负相关。

表1 24节气细菌群落组成的百分比例表

图5 细菌优势门在24节气内的含量变化Fig.5 Dominant Community composition in 24 solar terms

类群Groups门Phylum属Genus荧光片段T-RFs优势类群DominantCommunityActinobacteriaArthrobacter165Corynebacterium165Frankia130Nocardioides130Streptomyces130/165BacteroidetesFlavobacterium84/93/485Flexibacter93FirmicutesBacillus53/130/145/165Clostridium93/165/485Eubacterium270/485Paenibacillus130ProteobacteriaAcidithiobacillus165Acidiphilium441Geobacter130Thiothrix130FusobacteriaLeptotrichia165OthersOlavius165特殊类群ParticularCommunityActinobacteriaMicrobacterium165Mycobacterium165BacteroidetesCapnocytophaga84Cytophaga84Microscilla93ProteobacteriaAchromatium455Azoarcus84Azospirillum130/165Caulobacter130Desulfatiferula165Desulfobacter165Desulfofrigus165Stenotrophomonas455SpirochaetesTreponema165/305CyanobacteriaSynechococcus130Cylindrospermopsis148ChlorobiChlorobiaceae某属127Prosthecochloris127Deinococcus-ThermusDeinococcus270NitrospiraeLeptospirillum80TenericutesPhytoplasma212

根据24节气细菌群落的门组成与12项水文化学参数在CCA轴上的分布(图6-D),拟杆菌门、厚壁菌门和其他类群受氟和氡的影响最大；放线菌门、变形菌门和绿菌门受电导率影响较大；蓝藻门、异常球菌-栖热菌门和硝化螺菌门分别受到二氧化碳、水汞和硫化物的影响较大；12项水化参数对梭杆菌门的影响较小。

图6 24节气(A、B)、多样性(C)、细菌群落(D)与乌鲁木齐10号泉理化参数的典型相关性分析Fig.6 Canonical correspondence analysis between bacterial community(A、B)、 diversity(C)、dominant genus(D)parameters of the No. 10 spring

3 讨论

通过对乌鲁木齐10号泉水体细菌群落香农指数、辛普森指数及均匀度指数的计算和分析发现,24节气内,水体细菌群落呈现出秋升冬降春波动夏回升的趋势,且夏季的各项指数明显高于冬季。乌鲁木齐10号泉水温年变化甚微[2],故判断温度对出现此变化趋势的影响较小。分析原因可能为:(1)虽然10号泉属寡营养环境,但随着季节更替,外界环境温度的逐渐回升,泉区东南方的博格达山区大气降水与高山积雪融水的补给增多,泉水径流量增加,导致水体营养成分有所变化所致；(2)乌鲁木齐10号泉处于地震断裂带上,受地球内部活动的影响,细菌群落可能对氡、甲烷、流量、硫化物、电导率等地球水文化学因子产生得响应所致；(3)物候现象可对微生物群落产生影响所致。

细菌群落结构组成的分析表明：该环境下的微生物群落有优势类群和随机类群组成。放线菌门、拟杆菌门等5个门中的部分细菌类群(Arthbater,Corynebacterium,Flexibacter,Clostridium,Eubacterium,GeobacterDesulfobacter,Thiothrix等)为该环境下的优势群落,它们随时间、季节变化而稳定存在,对环境具有高度的适应性,这与Farnleitner等人[31]和Pronk等人[32]对不同冷泉系统微生物群落的研究结果相一致。随机类群包括放线菌门、拟杆菌门等5个门中部分随机出现的细菌类群和蓝藻门、异常球菌-栖热菌门等类群,它们在监测期内仅存在于某些特定季节或节气内,其丰度变化并无明显的规律可循,推测可能是受物候影响所致。例如：无色杆菌属(Achromatium)、嗜纤维菌属(Cytophaga)等仅出现在春季的各节气中；冷弯菌属(Psychroflexus)仅见于冬季的节气中；异常球菌属(Deinococcus)仅出现在立秋、立冬、立春和立夏节气附近。此外,群落中存在较为丰富的硫氧化菌类群(Acidithiobacillus、Thiothrix)和硫还原菌类群(Desulfobacter、Desulfoluna),他们共同维持着该环境下的硫循环。

12项水文化学参数对细菌群落影响的分析结果表明,理化参数的变化对10号泉水体细菌群落的多样性有显著影响,其中影响作用较大的因子有甲烷、流量、硫化物、氡及电导率等。乌鲁木齐10号泉中含有的CO2、H2、N2、HS、CH4等可作为潜在的电子供体和受体,它们可为微生物多样性的代谢类型提供可能[13],它们同时影响着泉水的电导率。在CCA排序轴上的排序显示,大部分的样品这几项指标的变化呈正相关,这一结果表明,细菌群落的多样性受多项环境因子的共同作用[33]。24节气样品基于T-RFs和群落组成门含量在CCA轴上的排序均显示春夏季节样品和秋冬季节样品具有差异性,结合5个优势门含量在24节气内的波动变化可知,拟杆菌门和厚壁菌门在含量上呈互补关系,受氟和氡的共同作用,春夏季节的各节气,优势的细菌类群为拟杆菌为代表的革兰氏阴性菌,秋冬季节的各节气,优势类群为厚壁菌为代表的革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌相比,细胞壁具有较厚的肽聚糖层,相关研究表明,肽聚糖具有抗新陈代谢活性、免疫调解活性等生物学功能[34],因而细胞壁中肽聚糖含量占干重30%—95%的革兰氏阳性菌[34],可能对恶劣环境具有更高的耐受性。

4 结论

乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构和多样性在24节气内的变化明显,水体细菌群落呈现出秋升冬降春波动夏回升的趋势,且夏季的各项指数明显高于冬季,群落多样性受水文化学参数的影响；乌鲁木齐10号泉中稳定存在有放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门及梭杆菌门的某些细菌种属,只是在各节气所占比例略有差别,此外,放线菌门、拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、蓝藻门、异常球菌-栖热菌门、绿菌门、柔膜菌门、螺旋体门及硝化螺菌门的某些种属存在于特定季节或节气内且含量相对较低；厚壁菌门为代表的革兰氏阳性菌对环境变化具有更好的耐受性。

由于T-RFLP技术的局限性[35],后续可结合克隆文库分析及核酸杂交分析来获得更加详实的信息,为深入研究乌鲁木齐10号泉水体微生物群落奠定更加坚实的基础。

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Structure changes of bacteria community in 24 solar terms at No.10 spring Urumqi

XUE Juan1,2, ZHANG Tao1, ZENG Jun1, LI Ping1,3, GAO Xiaoqi4, LOU Kai1,*

1InstituteofMicrobiology,XinjiangAcademyofAgricultureScience,Urumqi830091,China2CollegeofLifeScience,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China3CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China4SeismologicalBareauofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830011,China

Urumqi No.10 spring is located in the fracture zone of Willow ditch-Hongyanchi in southern Urumqi, and is one of the most important national key hydrological observation points. The spring water contains various geochemical elements, such as sulfide, methane, hydrogen, radon, sulfide, methane, carbon dioxide, helium, fluorine and mercury. Microbes living in the spring are intensely affected by hydro-geochemical changes caused by movements of the Earth′s crust. The 24 solar terms, part of the Chinese traditional calendar, can accurately reflect changes in the Earth′s climate, and the habitats of microorganisms also change with changes in the solar terms. In order to understand the changes in the structure of the bacterial community and diversity in Urumqi No.10 spring with the 24 solar terms, spring water samples collected during each period of the 24 solar terms were analyzed by T-RFLP, and CCA analysis combined with hydro-chemical analysis of indicators in the spring was conducted. Diversity analysis shows that the Shannon index (H) of the spring bacterial communities has a large variation (from 1.088 to 3.003). Spring samples (from ‘Beginning of Spring’ to ‘Grain Rain’) show a significant fluctuating trend and reaches its lowest value in ‘Waking of Insects’ (1.088); in summer (from ‘Beginning of Summer’ to ‘Greater Heat’) and autumn (from ‘Beginning of Autumn’ to ‘Frost’s Descent’), the index shows similar increasing trends within the solar terms, while for winter (from ‘Beginning of Winter’ to ‘Greater Cold’), the index remains at a low level (approximately 1.761). The changes in Simpson (D) and evenness index (E) were not significant throughout the 24 solar terms and the lowest value appeared in ‘Waking of Insects’. Hierarchical cluster analysis shows that the bacterial community patterns for the spring water appear to cluster with the solar terms, reflecting the similarity of the sample community composition between solar terms within the same season. Adjacent seasons show mild diversity, indicating that the bacterial community composition has intraseasonal variations. T-RFLP analysis shows that there are 11 phyla in total:Actinobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes,ProteobacteriaandFusobacteriaare the main taxa (≥70%), and their proportions vary in each solar term;Cyanobacteria,Deinococcus-Thermus,Spirochaetes,Nitrospirae,Chlorobi,Tenericutesand some unknown taxa only appear in some of the solar terms, are present in low numbers, but they occupy a very important position in the community composition; Gram-positive bacteria are abundant in autumn and winter, while Gram-negative bacteria dominate in spring and summer. The existence of sulfur-oxidizing bacteria (Acidithiobacillus,Thiothrix) and sulfate-reducing bacteria (Desulfobacter,Desulfoluna) may be related to the high H2S content in the spring. Hydrological chemical indicator analysis shows that conductivity, mercury, methane and hydrogen sulfide show the most variation. Of these indicators, fluorine and radon concentration can influence the dominant taxa, such asBacteroidetesandFirmicutes, whileDeinococcusis influenced by mercury concentration. These results indicate that the bacterial community in No.10 spring is influenced by changes in the 24 solar terms which in turn affect the hydrological chemical indicators.

24 solar terms; bacterial community structure; diversity; T-RFLP; No.10 Spring Urumqi

新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目(201216145)

2013- 01- 31; 网络出版日期:2014- 03- 13

10.5846/stxb201301310205

*通讯作者Corresponding author.E-mail: loukai02@mail.tsinghua.edu.cn

薛娟,张涛,曾军,李萍,高小其,娄恺.24节气内乌鲁木齐10号泉水体细菌群落结构变化.生态学报,2014,34(21):6214- 6224.

Xue J, Zhang T, Zeng J, Li P, Gao X Q, Lou K.Structure changes of bacteria community in 24 solar terms at No.10 spring Urumqi.Acta Ecologica Sinica,2014,34(21):6214- 6224.