柔肝化纤颗粒对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏 MMP-2、TIMP-2的影响

2014-08-08 01:01王振常杨删黄晶晶吕健林
疑难病杂志 2014年1期
关键词:柔肝计分化纤

王振常,杨删,黄晶晶,吕健林

论著·基础

柔肝化纤颗粒对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏 MMP-2、TIMP-2的影响

王振常,杨删,黄晶晶,吕健林

柔肝化纤颗粒;肝纤维化;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶-2抑制剂;大鼠

细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)降解减少、沉积过多是肝纤维化重要的形成机制之一,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)具有可降解大部分ECM成分的作用,MMP与其抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP)的表达在调控ECM的合成与降解中起着关键作用,MMP与TIMP失衡会引起ECM在肝内的代谢异常而导致肝纤维化形成[1],从调节ECM合成与降解平衡方面进行肝纤维化的防治可获得较好疗效。柔肝化纤颗粒是在已故全国名老中医林沛湘教授治疗慢性肝炎、肝炎肝硬化有效验方组方(壮肝逐瘀煎)基础上经模糊数学优化而成,经过多年临床实践其有效性毋庸置疑[2]。现观察柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠肝脏MMP-2和TIMP-2蛋白分布及表达的影响,为阐明其抗肝纤维化作用的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.3 观测项目 各组于用药治疗后5周、10周,禁食12 h,随机选取8只大鼠称体质量,经1%戊巴比妥麻醉,股静脉采血(血清于-70℃冰箱内保存备检测),而后处死剖取肝脏,取肝脏右叶相同部位组织1块置入10%甲醛中,作常规石蜡切片,将余下肝脏于液氮中速冻,-196℃保存,以备肝组织匀浆测Hyp(羟脯氨酸)、提取mRNA及RT-PCR分析用。肝组织切片免疫组织化学染色及计算机图像分析技术检测IV胶原、MMP-2及TIMP-2。采用半定量RT-PCR法分析肝组织MMP-2、TIMP-2 mRNA的表达差异。取PCR产物和PCR Markers各10μl,加缓冲液,琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,紫外透射反射分析仪下观察并摄像,图像分析软件分析电泳条带的面积和光密度,以平均值代表相应基因的表达量,并除以相应β-actin的mRNA平均值,即为MMP-2及TIMP-2的相对表达量。肝组织病理学观察及肝纤维化程度半定量检测参照文献[3]进行。

2 结 果

2.1 肝组织炎性反应活动度和肝纤维化变化 实验结束时处死大鼠为有效动物,B组大鼠肝组织炎性反应活动度计分、肝纤维化程度计分均较A组升高(P<0.05);与B组比较,治疗后C、D、E组大鼠肝组织炎性反应活动度、肝纤维化程度计分均明显降低(P<0.05);与C组比较,D、E组2指标升高(P<0.05);D、E组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠各时间段肝组织炎性反应活动度及肝纤维化程度计分

注:与A组比较,*P<0.05;与B组比较,#P<0.05;与C组比较,△P<0.05

2.2 肝组织内MMP-2、TIMP-2变化 与A组比较,B组MMP-2、TIMP-2、 MMP-2/TIMP-2水平明显升高(P<0.05);与B组比较,治疗后C、D、E组上述3项指标降低(P<0.05);与C组比较,D、E组上述3项指标增高(P<0.05),而D、E组间比较,差异无统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠各时间段肝组织内MMP-2、TIMP-2表达水平变化

注:与A组比较,*P<0.05;与B组比较,#P<0.05;与C组比较,△P<0.05

3 讨 论

总之,柔肝化纤颗粒能明显降低CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏MMP-2、TIMP-2的表达,维持MMP-2/TIMP-2之间的平衡,一方面降低MMP-2有助于减少基底膜破坏、维持肝脏组织正常结构和功能,另一方面TIMP-2表达减少有利于减少对MMP的抑制,从而促进ECM降解、防治肝纤维化。此外,我们的前期研究还发现其具有减少肝组织激活素A(ACTA)表达、提高血清卵泡抑素(FS)水平[15,16]的作用,从而减少肝细胞凋亡、促进肝细胞再生,说明柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的作用机制可能是多方面的,这为其临床应用提供了有力的理论依据。

1 Roy SC,Ghosh J.Dynamic in vivo changes in the activities of gelatinases,matrix metalloproteinases(MMPs),andtissue inhibitor of metalloproteinases(TIMPs) in buffalo(Bubalus bubalis)uterine luminal fluidduring estrous cycle andearly pregnancy[J].Mol ReprodDev,2010,77(11):944-953.

2 杨删,王婷,王振常.柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠FS表达的影响[J].广西中医药,2011,34(4):55-57.

3 王泰龄,刘霞,周元平,等.慢性肝炎炎症活动度及肝纤维化程度计分方案[J].中华肝脏病杂志,1998,6(4):195-197.

4 章培军,邢雁霞,刘斌钰,等.枸杞多糖对实验性肝损伤保护作用的研究[J].中国药物与临床,2011,11(11):1286-1287.

5 李超彦,周媛媛,王福青,等.黄精多糖对顺铂致肝损害大鼠肝功能的保护及抗氧化指标的影响[J].中国实验方剂学,2013,19(16):229-231.

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12 刘云霞,姚立,姚勇伟,等.益气补肾方对SGC-7901细胞MMP-2和TIMP-2基因表达的影响[J].中华中医药学刊,2011,29(7):1639-1642.

13 陈江,章荣华,吴蕙岭,等.实验性肝纤维化形成和逆转过程中MMP-2及其抑制物TIMP-2表达的动态研究[J].中国卫生检验杂志,2010,20(10):2401-2406.

14 张京红,卢振,方哲平.肝脏B超形态学变化、MMP-2及TIMP-2水平与肝纤维化分期的关系[J].中国现代医生,2013,51(17):58-60.

15 王振常,朱智德,杨删,等.柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠ACTA表达的影响[J].时珍国医国药,2012,23(11):2705-2707.

16 杨删,王婷,王振常.柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠FS表达的影响[J].广西中医药,2011,34(4):55-57.

EffectsofRouganhuaxianparticleonMMP-2andTIMP-2inratsmodelofliverfibrosisinducedbyCCl4

WANGZhenchang*,YANGShan,HUANGJingjing,LVJianlin.

*LiverCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Guangxi,Nanning530023,China

ObjectiveTo investigate the effects ofRouganhuaxianparticle on MMP-2 andTIMP-2 in rats model of liver fibrosis inducedby CCl4.MethodsSelect healthy andclean SPF level rats (n=78), they were randomly dividedinto normal control group (A group), pathological model group (B group),Rouganhuaxianparticle group (C group),Dahuangzhechongpill group (dgroup) andcolchicine control group (E group), the latter four groups were establishedCCl4-inducedliver fibrosis in rats, andthen were given saline,Rouganhuaxianparticles,Dahuangzhechongpills, colchicine gavage for 5 weeks and10weeks, respectively, after taking rat liver tissue, using immunohistochemical staining andcomputer image analysis to detect MMP-2 andTIMP-2.ResultsTreatment for 5 weeks, 10weeks comparedwith group A,B group liver inflammation activity meter points, liver fibrosis scores were significantly higher (P<0.05), C, D, E group was significantly lower than group B(P<0.05), where C group was significantly decreasedcomparedwith D, E group(P<0.05), while no statistically significant difference between the groups D, E (P>0.05);andcomparedwith A group, B group MMP-2, TIMP-2, MMP-2/TIMP-2 were significantly higher(P<0.05); comparedwith group B,group C, D, E MMP-2, TIMP-2 expression andMMP-2/TIMP-2 significantly decreased(P<0.05), C group decreasedmore obvious comparedwith D, E groups (P<0.05), while no statistically significant difference between the groups D, E (P>0.05).ConclusionRouganhuaxianparticle can prevent andcure liver fibrosis through regulate the ratio of MMP-2/TIMP-2.

Rouganhuaxianparticle; Liver fibrosis; MMP-2; TIMP-2;Rats

广西自然科学基金项目(No.2010GXNSFA013211)

530023 南宁,广西中医药大学第一附属医院肝病中心(王振常、黄晶晶、吕健林),530007 广西中医医药大学(杨删)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.01.026

2013-09-18)

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