沉默HepG2细胞核糖核酸酶抑制因子的shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

李琳+李坤+王福强+丁宁

[摘要] 目的 构建针对人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的shRNA逆转录病毒载体，为探讨hRI抗肿瘤作用机制打下基础。 方法 用亚克隆法将目的片段pkd-dsRI和pkd从表达载体pKD-dsRI克隆到pLNCX上，用双酶切筛选得到阳性克隆后，用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中，用800 mg/L G418筛选2周，产生稳定的细胞克隆后，用RT-PCR检测细胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表达的变化。 结果 双酶切鉴定为阳性克隆。RT-PCR表明，对比空白组（0.790±0.014）和空载体组（0.904±0.027），干扰组hri基因表达（0.361±0.048）明显下调，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 成功构建了针对hRI的shRNA逆转录病毒载体。

[关键词] 人核糖核酸酶抑制因子；shRNA；逆转录病毒载体；构建

[中图分类号] R394.33[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）05（b）-0014-04

Construction and identification of retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene in HepG2 cell

LI Lin1 LI Kun2▲ WANG Fuqiang3 DING Ning2

1.Department of Laboratory Medicine, Maternal and Child Care Service Centre of Dalian City, Liaoning Province, Dalian 116021, China; 2.School of Medicine, Dalian University, Liaoning Province, Dalian 116021，China; 3.Dalian Ocean University, Liaoning Province, Dalian 116021, China

[Abstract] Objective To construct the retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene, in order to provide basis for discussion of hRI antitumor effect. Methods The target fragments of pkd-dsRI and pkd from the vectors of pKD-dsRI were subcloned into the retroviral vector pLNCX respectively. The vector was identified by enzyme digested, then transfected into HepG2 cells with liposome method. After 2 weeks of selection of 800 mg/L G418, the silencing effect of the siRNA plasmid was identified by RT-PCR on the HepG2 cells. Results Restriction enzyme digestion proved that the construction of retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene was correct. RT-PCR showed that the expression of hri gene were significantly reduced in the HepG2 cells transfected with shRNA-hRI retroviral vector (0.361±0.048) as compared with the blank control group (0.790±0.014) and the blank retroviral vector group (0.904±0.027), with statistically significant difference (P < 0.05). Conclusion The retroviral vector expressing shRNA targeting hRI gene is successfully constructed.

[Key words] Human ribonuclease inhibitor; shRNA; Retroviral expression vector; Construction

人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor，hRI）是广泛存在于哺乳动物胞浆内的酸性糖蛋白，基因定位于11p15.5，分子量为50 kD[1-2]。研究发现，hRI是核糖核酸酶（RNase A）的抑制剂（Ki=4.0×10-14 mol/L），能有效抑制RNase A对RNA的水解[3]。hRI还可以与血管生长因子（Angiogenin，Ang）紧密结合（Ki=7.1×10-16 mol/L）而抑制Ang促血管生成的活性[3-4]。此外，hRI还具有抗机体氧化损伤功能[5]。综合国内外的研究，本课题组认为hRI能通过抑制Ang活性而抑制肿瘤新血管生成，对于肿瘤的生长、浸润及转移等过程具有抑制作用，推测其可能为肿瘤抑制基因的候选者之一。

为了证明hRI是否是肿瘤抑制因子，本研究将已构建的针对hRI基因的siRNA表达载体pKD-dsRI[6]的H1 Promotor和MCS区段亚克隆至逆转录病毒载体pLNCX的MCS中，获得有新霉素抗性的干扰载体pLNCX-pKD-dsRI，为下一步探讨hRI抗肿瘤作用及抗肿瘤基因治疗的应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pLNCX、E.coli DH5α由大连大学医学院（以下简称“我院”）生物化学与分子生物学教研室保存；针对人核糖核酸酶抑制因子siRNA表达载体pKD-dsRI（图1）由我院生物化学与分子生物学教研室构建。

图1 siRNA表达载体pKD-dsRI

限制性内切酶、DNA Marker、T4DNA连接酶购自TaKaRa；DNA快速凝胶产物回收试剂盒购自博大泰克公司；琼脂糖、氨苄青霉素和链霉素购自华美生物公司；LB培养基购自Invitrogen/GIBCO；G418和RT-PCR kit购自BBI；CellfectinR购自Invitrogen；Trizol、DEPC H2O购自上海生物工程有限公司；核酸序列分析软件primer 5.0、质粒绘制软件plasmid 2.0。

1.2 方法

1.2.1 重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建及鉴定质粒pLNCX用Hind Ⅲ单酶切质粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP补平、CIAP去除5'-磷酸末端后，用乙醇沉淀法回收得到约6.2 kb的平末端的线性化、去磷酸化的载体大片断。质粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后，经1%琼脂糖电泳切胶回收，获得目的片断（H1 Promotor-dsRI）；同样处理pKD，获得目的片断（H1 Promotor-MCS）。载体与片段用T4 DNA连接酶连接、转化后，获得重组载体pLNCX-pKD-dsRI。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI，筛选得到正向连接的阳性克隆。挑取单克隆，提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI，筛选得到正向连接的阳性克隆。将酶切筛选阳性克隆送TaKaRa测序鉴定。

1.2.2 HepG2细胞培养和转染细胞用DMEM培养基进行培养，补加0.03%谷氨酰胺，0.2% NaHCO3，0.59% Hepes（pH 7.2）， 10%热灭活（56℃，30 min）的胎牛血清及双抗（青霉素和链霉素各100 U/mL），培养条件为5％的CO2，培养温度37 ℃。细胞按4×104个/孔铺板于24孔板，至90%~95%汇片时，按CellfectinR说明书转染并分组：①空白组（正常细胞）；②空载体组（pLNCX-pKD载体转染组）；③干扰组（pLNCX-pKD-dsRI载体转染组），每组2复孔。每组质粒共用0.8 μg、脂质体2 μL，转染后24 h，换成含600 μg/mL G418的培养基培养选择2周，挑取G418的抗性单克隆，繁殖、扩增。

1.2.3 mRNA转录水平的检测采用Trizol试剂分别提取各孔中细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒按照两步法进行RT-PCR反应。以总RNA逆转录合成的cDNA为模板进行PCR反应。用于检测内源表达的RT-PCR引物：5'-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3'，5'-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3'，上游引物位于hri基因的No.27 bp，下游引物位于hri基因的No.559 bp，产物长度约为527 bp。β-actin引物 5'- gctgtccctgtacgcctctg-3'，5'-tgccgatggtgatgacctgg-3'，产物长度约为300 bp。由Bio-Rad凝胶成像仪摄取图像，Image LabTM软件对各个条带测定其面积及灰度值。用目的基因条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的基因的相对表达强度。干扰率=（相对表达强度空载体组-相对表达强度干扰组）/相对表达强度空载体组。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建及鉴定

2.1.1 重组载体pLNCX-pKD-dsRI的构建质粒pKD-dsRI用PvuⅡ酶切后获得约618 bp的目的片断pkd-dsRI；同样处理pKD，获得约534 bp的目的片断pkd（图2）。质粒pLNCX用HindⅢ单酶切质粒pLNCX、Klenow Fragment和dNTP补平和CIAP去除5'-磷酸末端后，回收得到约6.2 kb的平末端的线性化、去磷酸化载体大片断（图3）。

M1：DL2000 Marker；1：pKD-dsRI/PVUⅡ；2：pKD/PVUⅡ

图2 质粒pKD-dsRI、pKD单酶切电泳图

M1：λ-EcoT14 Ⅰdigested DNA Marker；1：pLNCX/HindⅢ

图3 质粒pLNCX单酶切电泳图

2.1.2 酶切鉴定阳性重组质粒pLNCX-pKD-dsRI-Neor和pLNCX-pKD-Neor用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pLNCX-pKD-dsRI，得到5523 bp和1305 bp两条片段（图4）；同样处理pLNCX-pKD-dsRI，得到5523 bp和1221 bp两条片段（图5）。

M1：DL2000 Marker；M2：λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker；1：pLNCX-pKD-neor/BamHⅠ+XhoⅠ

图4 pLNCX-pKD-dsRI-neor双酶切电泳图

M1：DL2000 Marker；M2：λ-EcoT14Ⅰdigested DNA Marker；1：pLNCX-pKD-dsRI-neor/BamHⅠ+ XhoⅠ（5523 bp和1221bp）；2：plasmid of pLNCX-pKD-neor

图5 pLNCX-pKD-neor双酶切电泳图

2.2 mRNA转录水平的检测

RT-PCR结果显示，空白组hri基因的相对表达强度为0.790±0.014，空载体组的相对表达强度为0.904±0.027，干扰组的相对表达强度为0.361±0.048。与空白组和空载体组对比，干扰组中hri基因均显著下调（P < 0.05），抑制率大于80%。可见，hri基因在转录后水平上分别被沉默（图6）。

M：DL2000 Marker；1：空白组中β-actin的表达；2：空白组中hri基因的表达；3：空载体组中β-actin的表达；4：空载体组中hri基因的表达；5：干扰组中hri基因的表达被干扰；6：干扰组中β-actin的表达

图6 RT-PCR检测转染hri基因在HepG2细胞中的表达

3讨论

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是双链RNA（double-strand RNA，dsRNA）介导的序列特异的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing， PTGS）现象。2001年Elbashir等[7]证明合成的双链siRNA在哺乳动物细胞中可实现靶基因特异沉默作用，由此RNAi被广泛用于特异基因的生物学功能的研究。目前常用的siRNA的制备方法有化学合成法、体外转录法、RNase Ⅲ消化法、siRNA质粒表达载体法、siRNA表达盒细胞内表达法等[8]，其中，质粒载体表达siRNA法，最常利用哺乳动物细胞启动子RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子如鼠和人U6-snRNA启动子、人RNase P（H1）启动子、人Val-tRNA启动子等调控表达siRNA或shRNA，但存在转染效率低等问题。由于逆转录病毒载体能将外源基因有效地整合到宿主细胞基因组中，并随细胞分裂而传给后代，所以使用逆转录病毒载体转染可以获得长期稳定的RNA干扰效果[9]。如Clontech的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express[10]、Oligoengine的pSUPER retro[11]、TaKaRa的pSINsi系列载体、Ambion公司的pSilencerTM 5.1 Retro[12]等。基于2002年Xia[13]等报道，细胞内RNA聚合酶Ⅱ依赖的启动子也能高效表达siRNA，Ambion公司的RNAi载体pSilencerTM 4.1-CMV neo利用改良Cytomegalomavirus （CMV）启动子表达shRNA，也实现了稳定RNA干扰作用。

本研究在瞬时载体pKD-dsRI基础上，将pKD的H1 promoter及其下游的MCS序列亚克隆至逆转录病毒pLNCX的MCS中，得到耐受新霉素的稳定表达沉默hRI的载体pLNCX-pKD-dsRI-neor。双酶切鉴定及在HepG2细胞内RT-PCR结果表明了干扰hRI基因的稳定表达载体构建成功。这为以后研究hRI基因的抗肿瘤作用及在基因治疗中的应用奠定了基础。

[参考文献]

[1]崔秀云，田余祥.核糖核酸酶抑制因子的研究[J].生命的化学，1995，15：24-25.

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[11]尹志华，任彩萍，李峰，等.利用报道基因检测鼻咽癌细胞的RNA干扰作用[J].癌症，2005，24（3）：371-375.

[12]尹昌林，吕胜青，黄轶，等.pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用[J].第三军医大学学报，2007，29（12）：1211-1214.

[13]Xia H，Mao Q，Paulson H，et al. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vitro [J]. Nat Biotechnol，2002，20：1006-1010.

（收稿日期：2014-02-27本文编辑：程铭）

[基金项目] 辽宁省教育厅科学研究一般项目（编号L2011219）；大连大学本科生创新课题（编号2013108）。

[作者简介] 李琳（1974-），硕士，副主任检验师；研究方向：分子生物学。

▲通讯作者

[参考文献]

[1]崔秀云，田余祥.核糖核酸酶抑制因子的研究[J].生命的化学，1995，15：24-25.

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（收稿日期：2014-02-27本文编辑：程铭）

[基金项目] 辽宁省教育厅科学研究一般项目（编号L2011219）；大连大学本科生创新课题（编号2013108）。

[作者简介] 李琳（1974-），硕士，副主任检验师；研究方向：分子生物学。

▲通讯作者

[参考文献]

[1]崔秀云，田余祥.核糖核酸酶抑制因子的研究[J].生命的化学，1995，15：24-25.

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[12]尹昌林，吕胜青，黄轶，等.pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用[J].第三军医大学学报，2007，29（12）：1211-1214.

[13]Xia H，Mao Q，Paulson H，et al. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vitro [J]. Nat Biotechnol，2002，20：1006-1010.

（收稿日期：2014-02-27本文编辑：程铭）

[基金项目] 辽宁省教育厅科学研究一般项目（编号L2011219）；大连大学本科生创新课题（编号2013108）。

[作者简介] 李琳（1974-），硕士，副主任检验师；研究方向：分子生物学。

▲通讯作者