哮喘分期序贯治疗对大鼠气道重构及过敏性气道炎症的影响

王力宁+钟李英+蒙春雪+刘利明+高冲+姚勇志+黄小琪+陈晶+梁丽英

[摘要] 目的 研究哮喘分期序贯治疗对大鼠哮喘模型气道重构及过敏性气道炎症的作用。 方法 56只SD大鼠随机分成正常组、哮喘组、序贯治疗1组、序贯治疗2组、序贯治疗3组、布地奈德组、孟鲁司特钠组，每组8只，除正常组外，其余各组均以卵蛋白（OVA）辅以氢氧化铝为佐剂于第1、8、15天注射致敏，22 d后隔天雾化吸入OVA 8周激发哮喘，建立哮喘模型。从实验第8天开始，给药组序贯治疗1组急性期麻杏二陈汤灌胃；序贯治疗2组急性期麻杏二陈汤灌胃，缓解期胃饲金水六君煎加减；序贯治疗3组急性期麻杏二陈汤灌胃，缓解期胃饲金水六君煎加减方，稳定期胃饲六味地黄颗粒；布地奈德组大鼠激发后雾吸沙丁胺醇，缓解期和稳定期雾吸布地奈德；孟鲁司特钠组激发后雾吸沙丁胺醇，缓解期和稳定期胃饲孟鲁司特钠；哮喘模型组以生理盐水胃饲代替，干预7周后观察实验大鼠全血白细胞总数、嗜酸性粒细胞计数，支气管平滑肌层、上皮下胶原、内管壁的厚度，肺组织羟脯氨酸含量。 结果 ①大鼠肺支气管病理学观察表明哮喘大鼠支气管平滑肌层、上皮下胶原、内管壁厚度[（27.87±0.81）、（9.11±0.58）、（39.00±3.68）μｍ]均较正常组[（10.76±0.67）、（3.37±0.42）、（20.40±2.85）μｍ]明显增厚，肺组织羟脯氨酸含量[（11.50±3.81）mg/g]较正常组[（5.71±0.80）mg/g]明显增高，差异均有统计学意义（P = 0.00），表明哮喘时存在气道重构。②序贯治疗1、2、3组、布地奈德组及孟鲁司特钠组对大鼠支气管平滑肌层、上皮下胶原、内管壁厚度、肺组织羟脯氨酸含量、全血白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数均比哮喘模型对照组低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 中药分期序贯治疗具有减轻哮喘气道慢性炎症和延缓气道重构的作用。

[关键词] 支气管哮喘；气道重构；分期序贯；实验研究

[中图分类号] R259[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）05（b）-0009-05

Effect of staging sequential treatment for airway remodeling and allergic airway inflammation of rats

WANG Lining1 ZHONG Liying2 MENG Chunxue3 LIU Liming2 GAO Chong2 YAO Yongzhi1 HUANG Xiaoqi1 CHEN Jing1 LIANG Liying1

1.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530023, China; 2.Guangxi University of Chinese Medicine, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530001, China; 3.Liuzhou Maternal and Child Health Hospital, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545001, China

[Abstract] Objective To analyze the effect of staging sequential treatment to airway remodeling and allergic airway inflammation of asthma rat models. Methods 56 male SD rats were randomly divided into group normal, group asthma, Sequential treatment group 1, 2, 3 and group Budesonide and group Montelukast, 8 rats in each group. For establishing asthma model, injection of egg ovalbumin (OVA) and aluminum hydroxide as adjuvant to the mice except for those in the normal control group were done in day 1, 8 and 15 for allergization, followed by an 8-week aerosol inhaling of OVA which started from day 22 and done once every two day as trigger of asthma. From day 8, Sequential treatment group 1 was given Ma Xing Er Chen Decoction i.g. in acute stage; sequential treatment group 2 was given Ma Xing Er Chen Decoction i.g. in acute stage and modified Jin Shui Liu Jun Decoction in remission stage; sequential treatment group 3 was given Ma Xing Er Chen Decoction i.g. in acute stage, modified Jin Shui Liu Jun Decoction by gastric gavage in remission stage and Liu Wei Di Huang Granule by gastric gavage in stable stage. Group Montelukast was given Salbutamol by aerosol inhalation at the onset of asthma and Montelukast i.g. in remission and stable stages. Group Budesonide was given Salbutamol by aerosol inhalation at the onset of asthma and Budesonide in remission and stable stages. The asthma model group was given normal saline i.g. After 7 weeks intervention, the total white blood cells, eosinophil cell count, the thickness of bronchial smooth muscle layer, subepithelial collagen, endotracheal tube wall, and the hydroxyproline content in lung tissue of all mice were examined. Results ①Compared with normal control group, the thickness of bronchial smooth muscle layer, subepithelial collagen, endotracheal tube wall, and the hydroxyproline content in lung tissue of asthma rats were remarkably higher [(27.87±0.81) μｍ vs (10.70±0.67) μｍ, (9.11±0.58) μｍ vs (3.37±0.42) μｍ, (39.00±3.68) μｍ vs （20.40±2.85）μｍ， (11.50±3.81) mg/g vs (5.71±0.80) mg/g, P = 0.00], which indicated the existence of airway remodeling in asthma. ②Compared with the asthma model group, the thickness of bronchial smooth muscle layer, subepithelial collagen, endotracheal tube wall, and the hydroxyproline content in lung tissue, total white blood cells and eosinophil cell count of sequential treatment group 1, 2, 3 and group Budesonide and group Montelukast were significantly lower (P < 0.05). Conclusion Staging sequential treatment of Chinese medicine exerts the function of relieving chronic airway inflammation in asthma and postponing airway remodeling.

[Key words] Bronchial asthma; Airway remodeling; Staging sequential; Experimental research

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞包括气道炎症细胞、结构细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]，是最常见的慢性疾病之一。支气管哮喘不仅存在气道炎症，而且还可发生气道结构的改变，即气道重构。气道重构是导致哮喘患者不可逆性气流阻塞及持续性非特异性气道高反应性（AHR）的重要原因[2]。为探讨运用中医温肺化痰-化痰养阴-滋阴补肾法分期序贯治疗对抑制哮喘气道炎症与阻止哮喘气道重构的作用，笔者对大鼠哮喘模型采用麻杏二陈汤加减方、金水六君煎加减方和六味地黄丸加减方进行分期序贯治疗，观察其对致敏哮喘大鼠全血中白细胞、嗜酸性粒细胞的数量、肺组织羟脯氨酸含量和支气管肺组织病理学改变情况的影响。结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用3～4周龄正常健康SD大鼠56只，雄性，体重（100±20）g，SPF级，广东省医学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK（粤）2008-0002。

1.2 药物

中药采用江阴天江药业有限公司生产的免煎中药饮片颗粒剂，其中麻杏二陈汤加减方由炙麻黄、杏仁、射干、僵蚕、莱菔子、细辛、陈皮、法半夏、云茯苓、甘草组成，并按5∶8∶8∶6∶8∶2∶4∶6∶8∶6比例配伍；金水六君煎加减方由当归、熟地、陈皮、法半夏、云茯苓、莱菔子、杏仁、射干、甘草组成，并按6∶10∶4∶6∶8∶8∶8∶8∶6 比例配伍；六味地黄丸加减方由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、白茯苓组成，并按8∶4∶4∶3∶3∶3比例配伍。各处方中药颗粒均分别用温开水调制成每毫升含生药1g的药液备用。孟鲁司特钠片（4 mg/片），由杭州默沙东制药有限公司分装，批号：B120718；布地奈德雾化混悬液（1 mg/2 mL），由澳大利亚阿斯利康有限公司生产，批号：LOT314902。吸入型硫酸沙丁胺醇溶液（5 mg/mL），由葛兰素史克集团生产，批号：C589099。

1.3 动物分组及处理

运用Excel软件[3]将56只大鼠按体重进行分层随机区组设计，随机分为序贯治疗1组（A1组）、序贯治疗2组（A2组）、序贯治疗3组（A3组）、孟鲁司特钠组（M组）、布地奈德组（B组）、哮喘模型组（X组）、正常对照组（Z组），每组8只。于第1、8、15天，X组、A1组、A2组、A3组、M组和B组各组每只大鼠腹腔注射10%卵清白蛋白（OVA）抗原溶液由美国Sigma公司提供，批号：A5253-10 g；氢氧化铝（分析纯）由天津市博迪化工有限公司生产，批号：20060213）1.0 mL致敏，正常对照组予生理盐水1.0 mL腹腔注射[4]。于实验第8天即第2次致敏的同一天开始，A2组隔天胃饲金水六君煎加减方20 g/（kg·d）；A3组隔天胃饲六味地黄颗粒20 g/（kg·d）；M组隔天胃饲白三烯受体拮抗剂[孟鲁司特钠4 mg/片，1 mg/（kg·d）]；B组大鼠隔天雾吸布地奈德[0.64 mL/（kg·d）]并予等量生理盐水胃饲，其余各组以生理盐水胃饲代替。

于实验第22天开始除Z组外各组均雾化（百瑞压缩雾化吸入机（ARI-1205型），德国百瑞有限公司生产）吸入1%OVA抗原溶液30 min以诱发哮喘，隔天1次，连续激发8周。

每次激发前2 h，A2组胃饲金水六君煎加减20 g/（kg·d）；A3组胃饲六味地黄颗粒20 g/（kg·d）；M组予孟鲁司特钠片1 mg/（kg·d）灌胃给药；B组雾化吸入布地奈德溶液（0.64 mL/kg）并予等量生理盐水胃饲，其余各组予等量生理盐水胃饲。

每次雾化后1 h内A1组、A2组、A3组大鼠均予麻杏二陈汤[20g/（kg·d）]灌胃；M组、B组予雾化吸入沙丁胺醇雾化液（0.32 mg/mL）并予等量生理盐水胃饲；其余各组予等量生理盐水胃饲。

在每次雾化后的第2天，A2组、A3组均胃饲金水六君煎加减方20 g/（kg·d）；M组予孟鲁司特片1 mg/（kg·d）灌胃给药；B组大鼠予雾化吸入布地奈德溶液（0.64 mL/kg）并予等量生理盐水胃饲，其余各组予生理盐水代替灌胃给药。

各组除施加以上药物干预因素外，给予常规同样方法进行饲养。

1.4 标本的采集

每组实验大鼠最后1次激发后24 h，称体重，20%乌拉坦5 mL/kg麻醉下，打开腹腔，用抗凝管采集腹股沟静脉血2 mL备用；打开胸腔取右肺下叶，均分为两份标本，一份以10%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色，用于光镜下大鼠气道组织病理观察；另一份以37%～40%甲醛溶液固定，用于羟脯氨酸含量测定。

1.4.1 支气管病理学观察[5]在光学显微镜放大200倍下选取完整的支气管横切面（内周长Pi为1500～2000 μm，中气道），最大内径与最小内径之比等于或大于2者（被认为是斜切的气道）除外。采用图像分析系统（pathological image analysis system）测定。分别测量支气管壁内周长（Pi）、气道平滑肌层面积（WAm=Amo-Am）、内管壁面积（WAi = Amo-Ai）、上皮层面积（WAc）；WAm，WAc，WAi与Pi的比值作为标化测量值，分别代表平滑肌层厚度（WAm/Pi）、支气管上皮层厚度（WAc/Pi）、支气管内壁厚度（WAi/Pi）。

1.4.2 肺组织羟脯氨酸含量测定试剂由南京建成生物工程研究所生产，实验步骤按照试剂盒上标明的实验步骤进行。将肺组织样品80～100 g剪碎，置于磨口试管中用保鲜膜封盖在保鲜膜上用针刺上小孔；放入水浴箱95℃水解5 h；水解液调pH值在6.0～6.8，加入蒸馏水至10 mL，混匀后；取3～4 mL稀释的检测液加入适量活性炭（20～30 mg），以上清液离心后澄清无色为准，混匀，3500 r/min离心（上海手术器械厂80-2型离心机）10 min，小心取上清1 mL，向各样品管中加入试剂一0.5 mL，混匀静置10 min；再加入试剂二0.5 mL，混匀静置5 min；在向各管中加入试剂三0.5 mL，混匀；放入60℃水浴箱水浴15 min，冷却后，3500 r/min离心10 min；取上清用756分光光度计（上海菁华仪器厂）在550 nm波比长色，1 cm光径，蒸馏水调零，测个管吸光度A值。用下列公式计算羟脯氨酸（HP）含量：肺组织HP含量（mg/g）=（0.5×A样/A标）/m，其中，A样为样品管吸光度，A标为标准管吸光度，m为肺重。

1.4.3 全血白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数检测采用自动化血液分析仪做血常规检验，取血样后送广西中医药大学第一附属医院检验科行血液学分析。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，采用q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学表现

观察发现X组大鼠进行激发前渐现明显过敏反应（如头部瘙痒、抓鼻、躁动不安）；激发1周后，每次激发后各治疗组逐渐出现躁动不安、打喷嚏、呼吸加快或俯卧少动、饮水增多、毛发渐渐发黄；激发后第2天到激发前各治疗组大鼠呼吸平顺，未见明显喘促，但A1、X组中多数大鼠可闻及明显痰鸣声；激发两周后X组大鼠出现精神萎靡、反应迟钝、弓背、前肢缩抬、节律性收腹样喘促，可闻哮鸣音及痰鸣音，甚至出现双耳及口唇发绀，更有甚者喘促至死，毛发渐渐枯槁发黄而无光泽，取出大鼠后，雾化箱内遗留屎尿较多。其他各治疗组与X组比较，过敏反应轻微，弓背、喷嚏等症状表现均较X组大鼠轻微，呼吸稍有增快，但未见明显喘促，毛色较白，取出大鼠后，雾化箱内遗留屎尿较多，A1组可闻及明显痰鸣声，激发后第2天偶见出现明显喘促，可闻及明显哮鸣音，A2、A3、B、M组未闻及明显哮鸣音和痰鸣音，各治疗组中A3组毛发均较白，皮毛有光泽，体重均较重；激发8周后，X组表现同上，各治疗组大鼠偶见头面部瘙痒，呼吸加快加深不明显，安静少动，基本保持常态，取出大鼠后，雾化箱内遗留屎尿较少，毛色白有光泽；正常对照组（Z组）大鼠行动敏捷，呼吸平稳，精神状态良好，皮毛有光泽。

2.2 支气管病理学观察

2.2.1 X组大鼠肺组织HE染色可见支气管上皮细胞脱落、增厚，黏膜下层亦有显著增厚；支气管平滑肌细胞增生活跃，平滑肌管腔狭窄；上皮下及平滑肌周围有大量的胶原沉积。支气管壁周围、管腔内及血管周围有大量炎症细胞浸润，气道壁及气道；各个治疗组与X组相比较，炎性反应较轻，支气管及肺泡炎性浸润也不明显，肺泡间隔仅有部分断裂，黏膜结构也较为完整。胶原沉积和气道壁各层厚度也较X组轻。而Z组HE染色切片支气管完整，组织结构正常。肺泡大小较一致，肺泡壁薄，肺泡腔无渗出，管腔内无渗出物，无出血、充血，周围无明显炎性反应。见图1～7。

2.2.2 各组大鼠气道病理组织学改变图像分析采用DC300病理图像采集系统（Leica，德国）分析，结果显示，X组大鼠平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、 支气管内壁厚度较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1）。各治疗组平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、支气管内壁厚度均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1），其中中药序贯治疗3组（A3组）比中药序贯治疗1组，中药序贯治疗2组薄，差异有统计学意义（P < 0.05）；与M组、B组疗效相当，除平滑肌厚度比M组薄，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）外，其余差异均无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 全血白细胞计数、嗜酸性粒细胞计数结果

全血白细胞（WBC）总数、嗜酸性粒细胞（EOS）计数统计结果如下，X组大鼠全血WBC计数、EOS细胞计数均较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）；各治疗组血液白细胞计数、嗜酸性粒细胞均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）。

2.4 肺组织HP含量结果

肺组织HP含量结果分析如下，X组大鼠HP含量较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）；各治疗组HP含量均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）。

表3 各组肺组织羟脯氨酸含量分析结果比较（mg/g，x±s）

注：与哮喘组比较，☆P ＜ 0.05

3 讨论

大量的实验研究证明，支气管哮喘不仅存在气道炎症，而且还发生气道结构的改变，即气道重构。气道重构是由各种炎性刺激、活化的炎症细胞产生并释放的多种炎症介质、细胞因子及生长因子等相互促进、相互制约，进行性发展而形成的。吸入性糖皮质激素是哮喘治疗的一线药物，早期预防性应用糖皮质激素吸入可有效预防气道炎症及气道重塑的发生，延迟应用可抑制气道炎性反应，但仅能部分逆转气道重塑的发生[6-7]。治疗哮喘的最终目标不仅仅是控制气道的炎症，而是防止气道结构改变。吸入性糖皮质激素能抑制气道平滑肌层增厚， 但这种作用是不完全的[8]。

中医认为“哮易止，根难除，故治哮必防哮，防哮必固本”，笔者遵照中医辨证论治的原则，依据小儿的生理病理特点与哮喘发病的机制及其病理演变的证候规律，经过多年治疗小儿哮喘的临床经验总结，提出了哮喘分期序贯治疗思路。急性发作期（发作期）辨明诱发原因，合理择方选药，宜温肺化痰，选用小青龙汤化裁成的麻杏二陈汤为主方；慢性持续期（缓解期）分清标本虚实，重在扶正固本，宜化痰养阴，选用金水六君煎为主方；缓解期（稳定期）分辨体质偏颇，科学因人施养，宜滋阴补肾，选用六味地黄丸为主方。在前期的实验研究中，验证了滋阴补肾的代表方六味地黄丸具有改善哮喘动物气道反应性及嗜酸性粒细胞炎症的作用[9]。

支气管哮喘是气道的慢性炎症性疾病，这种气道炎症是由嗜酸性粒细胞等炎症细胞参与形成的非特异性炎症，刘晓丽等[10]系统性回顾了31例哮喘儿童全血炎症细胞变化水平，数据显示，支气管哮喘和感染后哮喘组嗜酸性粒细胞百分比水平升高，故检测血嗜酸性粒细胞计数能间接反映气道炎症及其反应性的高低。实验中同时观察了中药分三期序贯治疗和西药抗炎平喘对SD哮喘大鼠全血嗜酸性粒细胞的影响，实验结果显示，哮喘模型组大鼠支气管病理切片中表现出明显的气道炎症，大鼠血液常规结果也提示，模型组大鼠白细胞总数比各治疗组高，差异有显著性，而各治疗组间疗效相当；对血液中嗜酸性粒细胞的影响，结果显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有统计学意义；各治疗组间，差异无统计学意义。说明经治疗后哮喘大鼠气道炎症得到改善，中药序贯治疗确实可以改善哮喘大鼠气道炎症的发生发展，与西药组抑制哮喘大鼠气道炎症的疗效一致。

哮喘时气道重构的主要病理学改变为气道壁的增厚。近年来很多对气道重构机制的影响研究中使用肺组织羟脯氨酸含量的高低可作为评断某个实验处理手段对哮喘气道重构影响是否有意义，是否能显著抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积。HP是机体胶原蛋白主要成分之一，不同组织中HP含量可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标，Szoltysik等[11]曾提出肺组织羟脯氨酸含量的测定也许可以作为哮喘的辅助检测指标。在本实验中，笔者在哮喘大鼠模型中研究中医温肺化痰-化痰养阴-滋阴补肾法分三期序贯治疗对哮喘支气管肺组织病理学改变情况及肺组织羟脯氨酸含量的影响。本实验选用了国内较常用的SD大鼠，大鼠致敏参考迟磊等[4]的方法，成功地诱发了气道过敏性炎症；隔天激发8周后，支气管病理图像分析结果显示，哮喘模型组大鼠平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、 支气管内壁厚度均较正常对照组增加，有显著性差异（P < 0.05），即哮喘大鼠支气管平滑肌层、支气管上皮层、内管壁均较对照组明显增厚，表明哮喘时存在气道重构[5]，结果分析显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有显著性意义，其中中药序贯治疗组从厚到薄均为A1>A2>A3，组间比较差异具有统计学意义。林两楷等[12]在常规治疗的基础上采用雾化吸入布地奈德联合口服孟鲁司特治疗支气管哮喘的方法疗效佳，有效率达92.5%，而本研究采用的中药序贯治疗3组（A3组）与M、B组疗效一致（P > 0.05），序贯治疗3组（A3组）能达到单纯使用布地奈德或布地奈德和孟鲁司特钠同用的相同疗效。同时实验还观察了哮喘大鼠肺组织羟脯氨酸含量，结果显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有统计学意义。说明中药序贯治疗和常规西药抗炎平喘治疗均可抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积，某种程度上来说可延缓或阻止气道重构的进程。

[参考文献]

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[4]迟磊，符州，戴继宏，等.过敏性哮喘大鼠模型的建立[J].重庆医学，2003，32（4）：429.

[5]高伟良，邱晨，袁庆莉.哮喘大鼠模型气道重构的病理形态学改变[J].广东医学，2006，27（2）：176-178.

[6]陈强，刘建梅，李莉，等.吸入性糖皮质激素对支气管哮喘患儿气道重塑的影响[J].中华哮喘杂志：电子版，2009，3（2）：95-100.

[7]朱灿红，季伟，周卫芳.吸入性糖皮质激素对哮喘气道重塑模型平滑肌的影响[J].江苏医药，2006，32（1）：50-51.

[8]李淼，尚云晓，魏兵.布地奈德吸入对哮喘气道重塑大鼠气道平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（2）：142-145.

[9]王力宁，刘含，黄小琪，等.六味地黄颗粒协同辅舒酮吸入对哮喘大鼠气道炎症的抑制作用[J].辽宁中医杂志，2006，33（1）：117-118.

[10]刘晓丽，王春靖，穆德毅，等.哮喘儿童外周血中炎症细胞变化及其相关因素分析[J].中国妇幼保健，2013，28（10）：1598-1599.

[11]Szoltysik E，Kueharz EJ. Serum markers of collagen metab olism in patients with diseases of the respiratory system[J].Rom J Intern Med，1993，31（2）：119-122.

[12]林两楷，谢海双，巫映霞.布地奈德联合孟鲁司特治疗支气管哮喘的疗效观察[J].中国医药指南，2012，10（8）：425-426.

（收稿日期：2014-01-20本文编辑：卫轲）

[基金项目] 国家自然科学基金项目（编号81160448）。

2.2 支气管病理学观察

2.2.1 X组大鼠肺组织HE染色可见支气管上皮细胞脱落、增厚，黏膜下层亦有显著增厚；支气管平滑肌细胞增生活跃，平滑肌管腔狭窄；上皮下及平滑肌周围有大量的胶原沉积。支气管壁周围、管腔内及血管周围有大量炎症细胞浸润，气道壁及气道；各个治疗组与X组相比较，炎性反应较轻，支气管及肺泡炎性浸润也不明显，肺泡间隔仅有部分断裂，黏膜结构也较为完整。胶原沉积和气道壁各层厚度也较X组轻。而Z组HE染色切片支气管完整，组织结构正常。肺泡大小较一致，肺泡壁薄，肺泡腔无渗出，管腔内无渗出物，无出血、充血，周围无明显炎性反应。见图1～7。

2.2.2 各组大鼠气道病理组织学改变图像分析采用DC300病理图像采集系统（Leica，德国）分析，结果显示，X组大鼠平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、 支气管内壁厚度较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1）。各治疗组平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、支气管内壁厚度均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1），其中中药序贯治疗3组（A3组）比中药序贯治疗1组，中药序贯治疗2组薄，差异有统计学意义（P < 0.05）；与M组、B组疗效相当，除平滑肌厚度比M组薄，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）外，其余差异均无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 全血白细胞计数、嗜酸性粒细胞计数结果

全血白细胞（WBC）总数、嗜酸性粒细胞（EOS）计数统计结果如下，X组大鼠全血WBC计数、EOS细胞计数均较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）；各治疗组血液白细胞计数、嗜酸性粒细胞均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）。

2.4 肺组织HP含量结果

肺组织HP含量结果分析如下，X组大鼠HP含量较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）；各治疗组HP含量均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）。

表3 各组肺组织羟脯氨酸含量分析结果比较（mg/g，x±s）

注：与哮喘组比较，☆P ＜ 0.05

3 讨论

大量的实验研究证明，支气管哮喘不仅存在气道炎症，而且还发生气道结构的改变，即气道重构。气道重构是由各种炎性刺激、活化的炎症细胞产生并释放的多种炎症介质、细胞因子及生长因子等相互促进、相互制约，进行性发展而形成的。吸入性糖皮质激素是哮喘治疗的一线药物，早期预防性应用糖皮质激素吸入可有效预防气道炎症及气道重塑的发生，延迟应用可抑制气道炎性反应，但仅能部分逆转气道重塑的发生[6-7]。治疗哮喘的最终目标不仅仅是控制气道的炎症，而是防止气道结构改变。吸入性糖皮质激素能抑制气道平滑肌层增厚， 但这种作用是不完全的[8]。

中医认为“哮易止，根难除，故治哮必防哮，防哮必固本”，笔者遵照中医辨证论治的原则，依据小儿的生理病理特点与哮喘发病的机制及其病理演变的证候规律，经过多年治疗小儿哮喘的临床经验总结，提出了哮喘分期序贯治疗思路。急性发作期（发作期）辨明诱发原因，合理择方选药，宜温肺化痰，选用小青龙汤化裁成的麻杏二陈汤为主方；慢性持续期（缓解期）分清标本虚实，重在扶正固本，宜化痰养阴，选用金水六君煎为主方；缓解期（稳定期）分辨体质偏颇，科学因人施养，宜滋阴补肾，选用六味地黄丸为主方。在前期的实验研究中，验证了滋阴补肾的代表方六味地黄丸具有改善哮喘动物气道反应性及嗜酸性粒细胞炎症的作用[9]。

支气管哮喘是气道的慢性炎症性疾病，这种气道炎症是由嗜酸性粒细胞等炎症细胞参与形成的非特异性炎症，刘晓丽等[10]系统性回顾了31例哮喘儿童全血炎症细胞变化水平，数据显示，支气管哮喘和感染后哮喘组嗜酸性粒细胞百分比水平升高，故检测血嗜酸性粒细胞计数能间接反映气道炎症及其反应性的高低。实验中同时观察了中药分三期序贯治疗和西药抗炎平喘对SD哮喘大鼠全血嗜酸性粒细胞的影响，实验结果显示，哮喘模型组大鼠支气管病理切片中表现出明显的气道炎症，大鼠血液常规结果也提示，模型组大鼠白细胞总数比各治疗组高，差异有显著性，而各治疗组间疗效相当；对血液中嗜酸性粒细胞的影响，结果显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有统计学意义；各治疗组间，差异无统计学意义。说明经治疗后哮喘大鼠气道炎症得到改善，中药序贯治疗确实可以改善哮喘大鼠气道炎症的发生发展，与西药组抑制哮喘大鼠气道炎症的疗效一致。

哮喘时气道重构的主要病理学改变为气道壁的增厚。近年来很多对气道重构机制的影响研究中使用肺组织羟脯氨酸含量的高低可作为评断某个实验处理手段对哮喘气道重构影响是否有意义，是否能显著抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积。HP是机体胶原蛋白主要成分之一，不同组织中HP含量可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标，Szoltysik等[11]曾提出肺组织羟脯氨酸含量的测定也许可以作为哮喘的辅助检测指标。在本实验中，笔者在哮喘大鼠模型中研究中医温肺化痰-化痰养阴-滋阴补肾法分三期序贯治疗对哮喘支气管肺组织病理学改变情况及肺组织羟脯氨酸含量的影响。本实验选用了国内较常用的SD大鼠，大鼠致敏参考迟磊等[4]的方法，成功地诱发了气道过敏性炎症；隔天激发8周后，支气管病理图像分析结果显示，哮喘模型组大鼠平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、 支气管内壁厚度均较正常对照组增加，有显著性差异（P < 0.05），即哮喘大鼠支气管平滑肌层、支气管上皮层、内管壁均较对照组明显增厚，表明哮喘时存在气道重构[5]，结果分析显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有显著性意义，其中中药序贯治疗组从厚到薄均为A1>A2>A3，组间比较差异具有统计学意义。林两楷等[12]在常规治疗的基础上采用雾化吸入布地奈德联合口服孟鲁司特治疗支气管哮喘的方法疗效佳，有效率达92.5%，而本研究采用的中药序贯治疗3组（A3组）与M、B组疗效一致（P > 0.05），序贯治疗3组（A3组）能达到单纯使用布地奈德或布地奈德和孟鲁司特钠同用的相同疗效。同时实验还观察了哮喘大鼠肺组织羟脯氨酸含量，结果显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有统计学意义。说明中药序贯治疗和常规西药抗炎平喘治疗均可抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积，某种程度上来说可延缓或阻止气道重构的进程。

[参考文献]

[1]中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31（3）：177-185.

[2]Rakesh K，Kumar. Understanding airway wall remodeling in asthma： a basis for improvements in therapy? [J]. Pharmacology & Therapeutics，2001，91（2）：93-104.

[3]周一平.用Excel软件进行药物毒理实验的随机分组[J].药学进展，2005，（29）：425-427.

[4]迟磊，符州，戴继宏，等.过敏性哮喘大鼠模型的建立[J].重庆医学，2003，32（4）：429.

[5]高伟良，邱晨，袁庆莉.哮喘大鼠模型气道重构的病理形态学改变[J].广东医学，2006，27（2）：176-178.

[6]陈强，刘建梅，李莉，等.吸入性糖皮质激素对支气管哮喘患儿气道重塑的影响[J].中华哮喘杂志：电子版，2009，3（2）：95-100.

[7]朱灿红，季伟，周卫芳.吸入性糖皮质激素对哮喘气道重塑模型平滑肌的影响[J].江苏医药，2006，32（1）：50-51.

[8]李淼，尚云晓，魏兵.布地奈德吸入对哮喘气道重塑大鼠气道平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（2）：142-145.

[9]王力宁，刘含，黄小琪，等.六味地黄颗粒协同辅舒酮吸入对哮喘大鼠气道炎症的抑制作用[J].辽宁中医杂志，2006，33（1）：117-118.

[10]刘晓丽，王春靖，穆德毅，等.哮喘儿童外周血中炎症细胞变化及其相关因素分析[J].中国妇幼保健，2013，28（10）：1598-1599.

[11]Szoltysik E，Kueharz EJ. Serum markers of collagen metab olism in patients with diseases of the respiratory system[J].Rom J Intern Med，1993，31（2）：119-122.

[12]林两楷，谢海双，巫映霞.布地奈德联合孟鲁司特治疗支气管哮喘的疗效观察[J].中国医药指南，2012，10（8）：425-426.

（收稿日期：2014-01-20本文编辑：卫轲）

[基金项目] 国家自然科学基金项目（编号81160448）。

2.2 支气管病理学观察

2.2.1 X组大鼠肺组织HE染色可见支气管上皮细胞脱落、增厚，黏膜下层亦有显著增厚；支气管平滑肌细胞增生活跃，平滑肌管腔狭窄；上皮下及平滑肌周围有大量的胶原沉积。支气管壁周围、管腔内及血管周围有大量炎症细胞浸润，气道壁及气道；各个治疗组与X组相比较，炎性反应较轻，支气管及肺泡炎性浸润也不明显，肺泡间隔仅有部分断裂，黏膜结构也较为完整。胶原沉积和气道壁各层厚度也较X组轻。而Z组HE染色切片支气管完整，组织结构正常。肺泡大小较一致，肺泡壁薄，肺泡腔无渗出，管腔内无渗出物，无出血、充血，周围无明显炎性反应。见图1～7。

2.2.2 各组大鼠气道病理组织学改变图像分析采用DC300病理图像采集系统（Leica，德国）分析，结果显示，X组大鼠平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、 支气管内壁厚度较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1）。各治疗组平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、支气管内壁厚度均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表1），其中中药序贯治疗3组（A3组）比中药序贯治疗1组，中药序贯治疗2组薄，差异有统计学意义（P < 0.05）；与M组、B组疗效相当，除平滑肌厚度比M组薄，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）外，其余差异均无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 全血白细胞计数、嗜酸性粒细胞计数结果

全血白细胞（WBC）总数、嗜酸性粒细胞（EOS）计数统计结果如下，X组大鼠全血WBC计数、EOS细胞计数均较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）；各治疗组血液白细胞计数、嗜酸性粒细胞均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表2）。

2.4 肺组织HP含量结果

肺组织HP含量结果分析如下，X组大鼠HP含量较Z组比较有增加，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）；各治疗组HP含量均较X组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）。

表3 各组肺组织羟脯氨酸含量分析结果比较（mg/g，x±s）

注：与哮喘组比较，☆P ＜ 0.05

3 讨论

大量的实验研究证明，支气管哮喘不仅存在气道炎症，而且还发生气道结构的改变，即气道重构。气道重构是由各种炎性刺激、活化的炎症细胞产生并释放的多种炎症介质、细胞因子及生长因子等相互促进、相互制约，进行性发展而形成的。吸入性糖皮质激素是哮喘治疗的一线药物，早期预防性应用糖皮质激素吸入可有效预防气道炎症及气道重塑的发生，延迟应用可抑制气道炎性反应，但仅能部分逆转气道重塑的发生[6-7]。治疗哮喘的最终目标不仅仅是控制气道的炎症，而是防止气道结构改变。吸入性糖皮质激素能抑制气道平滑肌层增厚， 但这种作用是不完全的[8]。

中医认为“哮易止，根难除，故治哮必防哮，防哮必固本”，笔者遵照中医辨证论治的原则，依据小儿的生理病理特点与哮喘发病的机制及其病理演变的证候规律，经过多年治疗小儿哮喘的临床经验总结，提出了哮喘分期序贯治疗思路。急性发作期（发作期）辨明诱发原因，合理择方选药，宜温肺化痰，选用小青龙汤化裁成的麻杏二陈汤为主方；慢性持续期（缓解期）分清标本虚实，重在扶正固本，宜化痰养阴，选用金水六君煎为主方；缓解期（稳定期）分辨体质偏颇，科学因人施养，宜滋阴补肾，选用六味地黄丸为主方。在前期的实验研究中，验证了滋阴补肾的代表方六味地黄丸具有改善哮喘动物气道反应性及嗜酸性粒细胞炎症的作用[9]。

支气管哮喘是气道的慢性炎症性疾病，这种气道炎症是由嗜酸性粒细胞等炎症细胞参与形成的非特异性炎症，刘晓丽等[10]系统性回顾了31例哮喘儿童全血炎症细胞变化水平，数据显示，支气管哮喘和感染后哮喘组嗜酸性粒细胞百分比水平升高，故检测血嗜酸性粒细胞计数能间接反映气道炎症及其反应性的高低。实验中同时观察了中药分三期序贯治疗和西药抗炎平喘对SD哮喘大鼠全血嗜酸性粒细胞的影响，实验结果显示，哮喘模型组大鼠支气管病理切片中表现出明显的气道炎症，大鼠血液常规结果也提示，模型组大鼠白细胞总数比各治疗组高，差异有显著性，而各治疗组间疗效相当；对血液中嗜酸性粒细胞的影响，结果显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有统计学意义；各治疗组间，差异无统计学意义。说明经治疗后哮喘大鼠气道炎症得到改善，中药序贯治疗确实可以改善哮喘大鼠气道炎症的发生发展，与西药组抑制哮喘大鼠气道炎症的疗效一致。

哮喘时气道重构的主要病理学改变为气道壁的增厚。近年来很多对气道重构机制的影响研究中使用肺组织羟脯氨酸含量的高低可作为评断某个实验处理手段对哮喘气道重构影响是否有意义，是否能显著抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积。HP是机体胶原蛋白主要成分之一，不同组织中HP含量可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标，Szoltysik等[11]曾提出肺组织羟脯氨酸含量的测定也许可以作为哮喘的辅助检测指标。在本实验中，笔者在哮喘大鼠模型中研究中医温肺化痰-化痰养阴-滋阴补肾法分三期序贯治疗对哮喘支气管肺组织病理学改变情况及肺组织羟脯氨酸含量的影响。本实验选用了国内较常用的SD大鼠，大鼠致敏参考迟磊等[4]的方法，成功地诱发了气道过敏性炎症；隔天激发8周后，支气管病理图像分析结果显示，哮喘模型组大鼠平滑肌层厚度、支气管上皮层厚度、 支气管内壁厚度均较正常对照组增加，有显著性差异（P < 0.05），即哮喘大鼠支气管平滑肌层、支气管上皮层、内管壁均较对照组明显增厚，表明哮喘时存在气道重构[5]，结果分析显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有显著性意义，其中中药序贯治疗组从厚到薄均为A1>A2>A3，组间比较差异具有统计学意义。林两楷等[12]在常规治疗的基础上采用雾化吸入布地奈德联合口服孟鲁司特治疗支气管哮喘的方法疗效佳，有效率达92.5%，而本研究采用的中药序贯治疗3组（A3组）与M、B组疗效一致（P > 0.05），序贯治疗3组（A3组）能达到单纯使用布地奈德或布地奈德和孟鲁司特钠同用的相同疗效。同时实验还观察了哮喘大鼠肺组织羟脯氨酸含量，结果显示各治疗组均比哮喘模型对照组低，差异具有统计学意义。说明中药序贯治疗和常规西药抗炎平喘治疗均可抑制气道壁平滑肌的增厚、胶原沉积，某种程度上来说可延缓或阻止气道重构的进程。

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[5]高伟良，邱晨，袁庆莉.哮喘大鼠模型气道重构的病理形态学改变[J].广东医学，2006，27（2）：176-178.

[6]陈强，刘建梅，李莉，等.吸入性糖皮质激素对支气管哮喘患儿气道重塑的影响[J].中华哮喘杂志：电子版，2009，3（2）：95-100.

[7]朱灿红，季伟，周卫芳.吸入性糖皮质激素对哮喘气道重塑模型平滑肌的影响[J].江苏医药，2006，32（1）：50-51.

[8]李淼，尚云晓，魏兵.布地奈德吸入对哮喘气道重塑大鼠气道平滑肌细胞MMP-9及TIMP-1表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（2）：142-145.

[9]王力宁，刘含，黄小琪，等.六味地黄颗粒协同辅舒酮吸入对哮喘大鼠气道炎症的抑制作用[J].辽宁中医杂志，2006，33（1）：117-118.

[10]刘晓丽，王春靖，穆德毅，等.哮喘儿童外周血中炎症细胞变化及其相关因素分析[J].中国妇幼保健，2013，28（10）：1598-1599.

[11]Szoltysik E，Kueharz EJ. Serum markers of collagen metab olism in patients with diseases of the respiratory system[J].Rom J Intern Med，1993，31（2）：119-122.

[12]林两楷，谢海双，巫映霞.布地奈德联合孟鲁司特治疗支气管哮喘的疗效观察[J].中国医药指南，2012，10（8）：425-426.

（收稿日期：2014-01-20本文编辑：卫轲）

[基金项目] 国家自然科学基金项目（编号81160448）。