流苏石斛组培快繁与炼苗移栽

罗鸣+刘海+李娟+吴明开+

摘要：以流苏石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）为试料，研究了种子萌发形成原球茎，原球茎的增殖培养、器官分化，建立了快速繁殖体系，经过初代培养、继代培养，成功培育出再生植株，并对组培苗的大棚移栽驯化等方面进行研究，初步形成从组培快繁到大棚生产的一系列培育过程，为流苏石斛的规模化生产发展奠定基础。

关键词：流苏石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）；无菌萌发；组织培养；炼苗驯化

中图分类号：S603.6文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1930-03

Tissue Culture and Traininｇ Ｐｌａｎｔｌｅｔ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．

ＬＵＯ Ｍｉｎｇ１，２，３，ＬＩＵ Ｈａｉ１，２，３，ＬＩ Ｊｕａｎ２，ＷＵ Ｍｉｎｇ－ｋａｉ２，３

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， rｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｂｕｌｂｓ， ｃｏｒｍｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｏｒｇａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ｉｎｉｔｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ． Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ. A ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｏｓｔｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ and ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ were ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｆｏｒｍｅｄ. It will ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．； ａｓｅｐｔｉｃ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｔｒａｉｎｉｎｇ ｐｌａｎｔｌｅｔ

流苏石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）又名马鞭石斛，为兰科石斛属附生植物，具有很高的药用价值，是收载于《中国药典》石斛的原植物之一［1］，其花非常艳丽，具有较高的观赏价值。现代药理研究表明石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用。在治疗恶性肿瘤、胃肠道疾病、糖尿病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的疗效［2-4］。近年来，随着市场需求量不断增加，野生资源被过度采挖，加上其自身繁殖特性以及对生长环境的特殊要求，流苏石斛野生资源濒临枯竭［5］。人工培育是解决珍稀濒危药用植物资源保护与满足市场需求矛盾的一种有效手段。流苏石斛辅以人工授粉可以获得大量种子，一个蒴果含有几万到十几万粒种子，但石斛种子自然萌发率极低，进行种子无菌萌发能获得大量组培苗［6-8］。目前种子无菌萌发技术较为成熟，但组培苗炼苗移栽技术不够成熟，缺乏大量健壮优质种苗成为制约流苏石斛进行规模化生产发展的技术瓶颈，本研究为获得健壮优质种苗及幼苗的批量生产奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

流苏石斛收集于云南省文山壮族苗族自治州，保存于贵州省农业科学院兰科植物活体保存圃中。

1.2培养基

初代培养基：1/2 MＳ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ，添加２５ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ ５．８。

继代培养基：１／２ ＭＳ＋ ０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，添加２５ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ琼脂，２００ ｇ／Ｌ马铃薯泥，ｐＨ ５．８。

壮苗生根培养基：改良培养基（ＷＭ）［９］＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、６．５ ｇ／Ｌ琼脂、１００ ｇ／Ｌ香蕉汁，ｐＨ ５．６。

1.3流苏石斛无菌播种

流苏石斛开花后进行人工授粉结实，采集后将蒴果在流水下冲洗干净，用吸水纸吸干水分，置于超净工作台上。用75%乙醇擦拭表皮2次，然后用0.1%的升汞浸泡10 min，用无菌水冲洗5次，用吸水纸吸干表面的水分，用灭菌后的医用脱脂棉包裹后，放置于4 ℃下保存。取出保存的蒴果进行播种，在无菌条件下，用解剖刀切开蒴果，将种子撒到培养基内。温度为（24±2） ℃，光照时间12 h/d，光照度2 000 lx，湿度30%~50%。

1.4流苏石斛组培苗炼苗移栽

移栽前先将瓶苗放置大棚内先炼苗5 d，让瓶苗从封闭稳定的环境向开放变化的环境过渡，慢慢适应自然环境。以生长健壮、叶色正常，肉质茎有3~4个节间、4~5片叶，4~5条根（长3 cm以上），根皮色白中带绿、无黑色根、无畸形、无变异的苗为试验材料。

组培苗出瓶时，将培养基与组培苗一起轻轻取出，放置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分别放置。特别要洗净培养基，以免剩余培养基发霉引起烂根，再换自来水清洗1~2次。污染苗经过清洗后，用1 000倍多菌灵浸泡整株小苗10 min，以控制污染。

将所有流苏石斛组培苗按茎长分为大（>6 cm）、中（4~6 cm）、小（<4 cm）3个等级（图3），每个等级选取30株长势相同的组培苗。将其栽种于树皮（2~3 cm）和细锯末的等量混合的培养基质中，选取优质种苗后，进行不同基质处理的炼苗试验，统计茎粗平均生长量和茎粗增长率。

处理Ⅰ：长度2~3 cm的树皮和细锯末的等量混合；处理Ⅱ：长度2~3 cm的树皮和直径1 cm的陶土等量混合；处理Ⅲ：兰花土和直径1 cm的陶土等量混合。

2结果与分析

2.1流苏石斛组培育苗结果

由图1可以看出，种子在播种初代培养基10 d后开始萌发；20 d后可以观察到流苏石斛种子由黄绿色变为绿色小圆球；40 d后绿色圆球发育出叶尖；60 d后绿色圆球进一步发育；80 d左右经过大部分发育生长出2片幼叶，同时原球茎大量增殖，这时为了保障组培苗的营养供应与充分发育，应及时进行转接培养，接种继代培养基。转接后的流苏石斛组培苗放置于温度为（22±2）℃、光照时间12 h/d、光照度2 000 lx、湿度30%~50%的培养室中培养，2~3个月后再进行转接培养，组培苗分蘖增殖，普遍形成丛苗，长势良好；在利用改良培养基进行壮苗生根培养，可以获得大量出瓶炼苗驯化移栽，根系发达的壮苗。

2.2流苏石斛组培苗炼苗移栽结果

炼苗处理100 d后对流苏石斛组培幼苗进行统计。小于4 cm的组培苗成活率为90.0%，4~6 cm的组培苗成活率为86.7%，大于6 cm的组培苗成活率最高为96.7%。然后以茎粗每隔25 d的平均生长量为依据，统计分析3种基质中30株茎长大于6 cm的流苏石斛幼苗的平均茎粗（表1）。炼苗驯化25 d时，处理Ⅲ平均茎粗增长率最大为63.70%；炼苗驯化50 d时，处理Ⅲ平均茎粗增长率最大为133.09%；但驯化75 d时，处理Ⅰ平均茎粗增长率最大为203.59%，高于处理Ⅱ、Ⅲ的平均茎粗增长率；并且在100 d时，处理Ⅰ平均茎粗增长率达到208.01%，生长优势更为明显。

3小结与讨论

流苏石斛种子无菌萌发适宜培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L琼脂，pH 5.8，种子萌发快，萌发率高；继代培养适宜培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，200 g/L马铃薯泥，pH 5.8，组培苗生长旺盛；壮苗生根适宜培养基为改良培养基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壮、根系发达。

流苏石斛作为中药材，既可以全株入药，也可以新鲜茎入药，因此茎粗、株高、新根数等都是衡量产量的重要指标。根据各个基质处理的茎粗信息，处理Ⅰ中的组培苗在生长过程中茎较粗，更能促进流苏石斛的生长发育，其特点是锯末比例较高，基质通透性和保水保肥性比较好，更适合铁皮石斛生长［10］。处理Ⅱ保水保肥性能较差，不适合流苏石斛的生长。处理Ⅲ由于使用兰花土导致基质通透性变差，也不太适合流苏石斛的生长。

参考文献：

［１］国家药典委员会． 中华人民共和国药典［Ｍ］．北京：中国医药科学技术出版社，２０１０．

［２］高学敏．中药学［Ｍ］．北京：中国中医药出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王宪楷，赵同芳．石斛属植物的化学成分与中药石斛［Ｊ］．中国药学杂志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

［４］王康正，高文远．石斛属药用植物研究进展［Ｊ］．中草药，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

［５］刘强，殷寿华，黄文，等．流苏石斛濒危原因及资源保护［Ｊ］．亚热带植物科学，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黄勇．流苏石斛组织培养体系研究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余乐，兰芹英，汤庚国．流苏石斛种子非共生萌发的研究［Ｊ］． 福建林学院学报，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黄卫昌，殷丽青，胡永红，等．流苏石斛的离体快速繁殖［Ｊ］．上海交通大学学报（农业科学版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吴明开，朱国胜，毛堂芬，等．正交试验优选环草石斛组培苗壮苗生产工艺［Ｊ］． 激光生物学报，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益红，孙红杰，史冀清．苏州地区铁皮石斛移栽基质优化筛选研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（责任编辑 屠晶）

2.2流苏石斛组培苗炼苗移栽结果

炼苗处理100 d后对流苏石斛组培幼苗进行统计。小于4 cm的组培苗成活率为90.0%，4~6 cm的组培苗成活率为86.7%，大于6 cm的组培苗成活率最高为96.7%。然后以茎粗每隔25 d的平均生长量为依据，统计分析3种基质中30株茎长大于6 cm的流苏石斛幼苗的平均茎粗（表1）。炼苗驯化25 d时，处理Ⅲ平均茎粗增长率最大为63.70%；炼苗驯化50 d时，处理Ⅲ平均茎粗增长率最大为133.09%；但驯化75 d时，处理Ⅰ平均茎粗增长率最大为203.59%，高于处理Ⅱ、Ⅲ的平均茎粗增长率；并且在100 d时，处理Ⅰ平均茎粗增长率达到208.01%，生长优势更为明显。

3小结与讨论

流苏石斛种子无菌萌发适宜培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L琼脂，pH 5.8，种子萌发快，萌发率高；继代培养适宜培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，200 g/L马铃薯泥，pH 5.8，组培苗生长旺盛；壮苗生根适宜培养基为改良培养基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壮、根系发达。

流苏石斛作为中药材，既可以全株入药，也可以新鲜茎入药，因此茎粗、株高、新根数等都是衡量产量的重要指标。根据各个基质处理的茎粗信息，处理Ⅰ中的组培苗在生长过程中茎较粗，更能促进流苏石斛的生长发育，其特点是锯末比例较高，基质通透性和保水保肥性比较好，更适合铁皮石斛生长［10］。处理Ⅱ保水保肥性能较差，不适合流苏石斛的生长。处理Ⅲ由于使用兰花土导致基质通透性变差，也不太适合流苏石斛的生长。

参考文献：

［１］国家药典委员会． 中华人民共和国药典［Ｍ］．北京：中国医药科学技术出版社，２０１０．

［２］高学敏．中药学［Ｍ］．北京：中国中医药出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王宪楷，赵同芳．石斛属植物的化学成分与中药石斛［Ｊ］．中国药学杂志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

［４］王康正，高文远．石斛属药用植物研究进展［Ｊ］．中草药，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

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［６］ 黄勇．流苏石斛组织培养体系研究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余乐，兰芹英，汤庚国．流苏石斛种子非共生萌发的研究［Ｊ］． 福建林学院学报，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黄卫昌，殷丽青，胡永红，等．流苏石斛的离体快速繁殖［Ｊ］．上海交通大学学报（农业科学版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吴明开，朱国胜，毛堂芬，等．正交试验优选环草石斛组培苗壮苗生产工艺［Ｊ］． 激光生物学报，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益红，孙红杰，史冀清．苏州地区铁皮石斛移栽基质优化筛选研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（责任编辑 屠晶）

2.2流苏石斛组培苗炼苗移栽结果

炼苗处理100 d后对流苏石斛组培幼苗进行统计。小于4 cm的组培苗成活率为90.0%，4~6 cm的组培苗成活率为86.7%，大于6 cm的组培苗成活率最高为96.7%。然后以茎粗每隔25 d的平均生长量为依据，统计分析3种基质中30株茎长大于6 cm的流苏石斛幼苗的平均茎粗（表1）。炼苗驯化25 d时，处理Ⅲ平均茎粗增长率最大为63.70%；炼苗驯化50 d时，处理Ⅲ平均茎粗增长率最大为133.09%；但驯化75 d时，处理Ⅰ平均茎粗增长率最大为203.59%，高于处理Ⅱ、Ⅲ的平均茎粗增长率；并且在100 d时，处理Ⅰ平均茎粗增长率达到208.01%，生长优势更为明显。

3小结与讨论

流苏石斛种子无菌萌发适宜培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA +2.0 mg/L 6-BA，添加25 g/L蔗糖，6.5 g/L琼脂，pH 5.8，种子萌发快，萌发率高；继代培养适宜培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，添加25 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，200 g/L马铃薯泥，pH 5.8，组培苗生长旺盛；壮苗生根适宜培养基为改良培养基（WM）［9］+2 mg/L NAA，添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂、100 g/L香蕉汁，pH 5.6，苗壮、根系发达。

流苏石斛作为中药材，既可以全株入药，也可以新鲜茎入药，因此茎粗、株高、新根数等都是衡量产量的重要指标。根据各个基质处理的茎粗信息，处理Ⅰ中的组培苗在生长过程中茎较粗，更能促进流苏石斛的生长发育，其特点是锯末比例较高，基质通透性和保水保肥性比较好，更适合铁皮石斛生长［10］。处理Ⅱ保水保肥性能较差，不适合流苏石斛的生长。处理Ⅲ由于使用兰花土导致基质通透性变差，也不太适合流苏石斛的生长。

参考文献：

［１］国家药典委员会． 中华人民共和国药典［Ｍ］．北京：中国医药科学技术出版社，２０１０．

［２］高学敏．中药学［Ｍ］．北京：中国中医药出版社， ２００２．５５３．

［３］ 王宪楷，赵同芳．石斛属植物的化学成分与中药石斛［Ｊ］．中国药学杂志，１９８６，２１（１１）：６６６-669．

［４］王康正，高文远．石斛属药用植物研究进展［Ｊ］．中草药，１９９７， ２８（１０）：６３３-635．

［５］刘强，殷寿华，黄文，等．流苏石斛濒危原因及资源保护［Ｊ］．亚热带植物科学，２００７，３６（４）：４５－４７．

［６］ 黄勇．流苏石斛组织培养体系研究［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０， ３８（２）：６２７－６２８．

［７］余乐，兰芹英，汤庚国．流苏石斛种子非共生萌发的研究［Ｊ］． 福建林学院学报，２０１１，３１（４）：３４６－３４８．

［８］ 黄卫昌，殷丽青，胡永红，等．流苏石斛的离体快速繁殖［Ｊ］．上海交通大学学报（农业科学版），２００８，２６（６）：５８４－５８７．

［９］ 吴明开，朱国胜，毛堂芬，等．正交试验优选环草石斛组培苗壮苗生产工艺［Ｊ］． 激光生物学报，２００８，１７（２）：２６５－２６９．

［１０］郭益红，孙红杰，史冀清．苏州地区铁皮石斛移栽基质优化筛选研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２０１１，39（6）：3258-3259，3261.

（责任编辑 屠晶）