钙结合蛋白S100A12研究进展

雍康+张传师+杨庆稳+姚学萍+曹随忠+

摘要：Ｓ１００Ａ１２属于Ｓ１００蛋白家族成员，具有上调内皮细胞黏附分子、活化炎性细胞、趋化特性和抗菌活性等功能。综述了Ｓ１００蛋白的分类及分布、Ｓ１００Ａ１２基因、ｍＲＮＡ和蛋白质结构及离子结合特性、与晚期糖基化终末产物受体的关系、组织及亚细胞定位、在不同疾病与组织中的表达、重组蛋白的抗菌活性等的研究进展。旨在为进一步研究Ｓ１００Ａ１２基因功能和筛选炎性早期诊断指标奠定基础，同时为开发重组多肽控制炎症提供相应资料。

关键词：钙结合蛋白Ｓ１００Ａ１２；表达；抗菌；炎症

中图分类号：Ｑ５１文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1742－０4

Ｔｈｅ Advance ｏｆ Studying Ｓ１００Ａ１２

ＹＯＮＧ Ｋａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕａｎ－ｓｈｉ１， ＹＡＮＧ Ｑｉｎｇ－ｗｅｎ１，ＹＡＯ Ｘｕｅ－ｐｉｎｇ２，ＣＡＯ Ｓｕｉ－ｚｈｏｎｇ２

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１５５，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａａｎ６２５０１４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓ１００Ａ１２， ａｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ Ｓ１００ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ， ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｖａｒｉｏｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ， ｃｈｅｍｏ ｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Tｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ１００ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｓ１００Ａ１２ ｇｅｎｅ， ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ and ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓ１００Ａ１２ ａｎｄ ＲＡＧＥ， ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｓｕｂ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ of Ｓ１００Ａ１２， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ１００Ａ１２ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ were revieuled． Ｔｈｅ ｓｕｍｍａｒｙ will be helpful ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙing ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ１００Ａ１２ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， and proviting ｒｅｌｅｖａｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐing ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅs ｃｏｎｔｒｏｌling ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓ１００ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１２（Ｓ１００Ａ１２）； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ； ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ

S100A12基因是1994年首先在猪粒细胞中发现的［1］。它曾有多种命名：钙粒蛋白C（CAGC）、MRP6、Co-Ag、CGRP、EN-RAGE以及CAAF1［2］。医学临床发现， S100A12具有重要的细胞外活性，在川崎病、类风湿性关节炎、炎症性肠病和慢性肺囊性纤维化、子宫内膜炎等疾病患者的不同组织中高度表达［3-7］，已成为诊断这些疾病的可靠指标。

1S100蛋白的分类及分布

S100蛋白是Moore等1965年首先在牛脑组织中发现的钙调节蛋白，属肌钙蛋白C家族［2］。这是一组低分子量（9～14 kDa）的酸性蛋白质，是钙结合蛋白家族中最大的子群。到目前为止，发现了包括S100A1~A13、S100P、S100B、Reperin、前丝凝蛋白（Profilaggrin）及毛透明蛋白（Trychohyalin）等在内的21个S100蛋白家族成员，它们在氨基酸水平上存在20%~80%程度不等的一致性序列［8，9］。

S100蛋白具有两个EF手型结构，末端序列较短。除了S100G，所有S100蛋白都是严格对称的。N端呈环状结构，通常由14个氨基酸组成，与钙离子的亲和性低，C端由12个氨基酸组成，与钙离子则有较高的亲和性。两个螺旋位于每个EF手型的钙离子结合环两侧。除了S100G外，每个S100蛋白包含可变长度的中央铰链区、C-端可变区和N-端可变区［2，8］。S100蛋白一直被认为是一种钙传感器蛋白，这是因为它与钙离子结合后，其构象会发生改变，一些靶蛋白的结合位点会暴露出来，进而通过与相应的靶蛋白结合，调节某些多肽的功能或亚细胞分布，在细胞增殖、分化、凋亡、基因表达、分泌及肌肉收缩过程中发挥重要作用［2，8］。

目前研究认为， S100蛋白发挥生物学功能的重要形式是二聚体。细胞内S100A12以反平行二聚体形式存在，经钙离子激活与靶蛋白相互作用调节细胞功能。胞外S100A12主要以二聚体及六聚体形式存在，分别表现出细胞因子样特性。S100B蛋白不仅可以结合钙离子，还能结合锌离子，并且亲和力较高。锌离子与S100B蛋白中的组氨酸残基结合后，可以使C端构象发生改变，钙结合位点之间的距离得到缩短［2］。编码人类S100A1~S100A16这16种蛋白的基因都定位于1q21，该区段染色体稳定性较差，易发生杂合性缺失、易位、重叠等多种染色体重排，与肿瘤关系十分密切［2］。S100蛋白的生物学功能多涉及调节钙离子稳态、调节酶活性、调节细胞生长分化，参与细胞骨架建立、蛋白质的磷酸化，作为转录因子参与炎症反应等［2］。

2S100A12基因，mRNA和蛋白质结构及离子结合特性

S100A12基因定位于人类染色体1q21.2-1q22（1q21.3），其染色体定位介于S100A8和S100A9之间，其蛋白相对分子质量为10 575，由92个氨基酸组成［2］。虽然在染色体上S100A12与S100A8、S100A9之间的距离较近，但其并不与S100A8、S100A9或者S100A8/S100A9复合物形成复合体［2］。人类S100A12基因长约4.1 kbp。聚腺苷酸完全拉伸，mRNA含有466个碱基（No.NM_005621）。该基因有3个外显子，被两个900bp和400bp的内含子分开。第一外显子（48个核苷酸）是非编码区，它包含了5′-UTR。一个经典的TATA盒（TATAAA）位于30个核苷酸转录起始位点的上游。外显子2含有部分5′-UTR（20个核苷酸），外显子3包含3′-UTR（122个核苷酸）。外显子2（138个核苷酸）和3（138个核苷酸）编码蛋白质，EF手型的蛋白质分别由第二和第三外显子编码［2］。成熟S100A12包含91个氨基酸，缺少N-末端蛋氨酸残基。发现S100主要在脊椎动物表达，而在软骨动物体内不表达［2］。

人类S100A12序列与猪、兔有70％的同源性，与牛有66％的同源性［2］。人类S100A12分别与人S100A8（钙粒蛋白A，髓相关蛋白8）、S100A9（钙粒蛋白B，髓相关蛋白14）有40％、46％的同源性。在啮齿动物中未曾发现S100A12基因的表达，S100A8似乎是一个功能同源基因［2］。与大多数S100蛋白家族成员一样，S100A12蛋白也由两个EF手型结构组成，EF手型结构又由结合于钙离子的螺旋-环-螺旋配基组成，中央为铰链区，两侧为疏水区，主要以共价二聚体形式存在［2］。

大部分S100蛋白构象及功能的不同取决于细胞内外钙、锌、铜的离子浓度［2］。一般来说，S100蛋白每个二聚体上可以结合4个钙离子，与C-末端EF手型亲和力较高，而与N端EF手型亲和力则较低。人类S100A12在六聚体结构上，除了EF-手型结合2个钙离子外，每个亚基还能结合钙离子。这就使得每个六聚体上额外地增加了6个钙离子，增加的6个钙离子被来自两个相邻的二聚体残基所协调［2］。像其他EF-手型蛋白，S100蛋白还能在EF-手型部位结合镁离子，但亲和力比较低。相对于镁、钙离子的选择性是非常高的。S100A12蛋白上也有锌离子结合位点，这个结合位点由亚基和密切位于二聚体的接口构成。值得一提的是，二价铜离子可能与锌离子结合在同一位点。这些阳离子可以调节细胞内外S100A12的功能［2］。从猪粒细胞分离S100A12单体研究表明，通过锌离子，S100A12与钙离子结合的亲和力有了巨大的调节。当铜离子与S100A12二聚体密切接触时可能使它们的靶蛋白结合位点或低聚物的结构发生改变。目前，S100A12是否成为其他铜调节蛋白的伴侣或充当铜稳态调节者被广泛讨论［2］。

3S100A12与晚期糖基化终末产物受体的关系

晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products，AGE）受体（The receptor for advanced glycation end products，RAGE）是一种具有重要生物学功能的多配体受体，其配体中包括AGE、S100/钙粒蛋白家族、β淀粉样肽及两性素/高速泳动族盒1蛋白等［9］。RAGE能够结合一些S100蛋白家族成员，包括S100A12、S100A1、S100B和S100P［10］。是否结合其他S100蛋白如S100A4、S100A13、S100A8和S100A9，至今仍有争议［2］。S100A12与RAGE结合后通过NF-KB和MAPK通路进行信号传导，增强细胞间黏附分子-1（ICAM-1），血管细胞黏附分子-1（VCAM-1），核因子KB和肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达，直接引起单核吞噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞活化，结果导致促炎性细胞因子的合成与分泌［11］。因此，这个作用的中断成功地阻碍了小鼠迟发型过敏和结肠炎。此外，RAGE途径的活化对伤口愈合和肿瘤生长代谢以及淀粉样变性很重要。有证据表明，S100A12也可能与细胞表面不存在RAGE配体的结合位点结合，比如与肥大细胞结合，从而证实了RAGE不是S100A12的惟一受体这一观点。最近证实，一个G-蛋白偶联机制对非RAGE介导的肥大细胞和单核细胞发挥作用［2］。此外，S100A12和S100A13以钙依赖的方式结合抗过敏药物，如肥大细胞稳定剂氨来占诺、色甘酸钠、曲尼司特和奥洛他定等［2］。这表明S100A12和S100A13可能以非RAGE依赖的方式参与了肥大细胞脱颗粒［2］。有研究显示，S100B和S100A12均可作为RAGE的内源性配体，二者作用于RAGE后可激活多种免疫细胞和炎性细胞，在机体的免疫反应和炎症反应中发挥着重要作用［2］。研究发现，S100P也可以作为RAGE的配体，两者相互作用后可以调节胰腺癌细胞的存活、生长及侵袭［12］。RAGE在正常组织及血管中表达量较低而在肺组织、糖尿病患者的内皮细胞、平滑肌细胞及单核巨噬细胞中呈现高表达［2］。

4S100A12组织及亚细胞定位

在人体组织中，S100A12基因的表达几乎完全局限于嗜中性粒细胞，大约占总静息中性粒细胞胞浆蛋白的5％［2］。单核细胞也表达S100A12，但较中性粒细胞少。在分化的早期阶段，上皮细胞和树突状细胞中也发现了S100A12的表达［2］。在正常条件下，S100A12的表达可以在中性粒细胞和单核/巨噬细胞最丰富的组织和器官（如脾和肺）中观察到。在缺乏钙离子的情况下，细胞内S100A12主要存在于细胞质中，当钙离子浓度增加时，可诱导S100A12分别向膜和细胞骨架组成部分迁移［2］。

5S100A12在不同疾病与组织中的表达

Ebihara等［3］以实时定量PCR检测了川崎病患儿急性期及缓解期白细胞中S100蛋白家族基因的表达情况。结果发现S100A6、S100A8、S100A9、S100A11、S100A12、S100P及S100Z在急性期均呈现高表达，特别是S100A8、S100A9及S100A12；Foell等［4］用免疫组化对42例内风湿性关节炎患儿关节滑膜中S100A12的表达情况检测时发现，S100A12在炎症性滑液组织中增量表达，但是，在对照组和已经成功控制病情患儿的关节滑膜中几乎检测不到，据此推测S100A12蛋白可作为类风湿性关节炎的诊断指标。Kaiser等［5］提出粪便中粒细胞分泌的S100A12蛋白有助于鉴别炎症性肠病与肠激惹综合征。相对于肠激惹综合征者和健康对照者，活动性炎症性肠病患儿的粪便中S100A12蛋白表达水平明显增高。Wittkowski等［6］、 Lorenz等［7］先后对急性肺伤和急慢性肺部疾病患者支气管肺泡灌洗液中S100蛋白进行检测时发现，S100A8/A9、S100A12、RAGE的表达明显高于健康组，而S100A12的表达水平在病情好转后明显下降。据报道，S100A12、S100A8、S100A9也是检测子宫内膜炎和胎儿是否流产的可靠指标［13］。同样，在幽门螺杆菌感染儿童的胃黏膜中也发现了这三种基因的表达［14］。Chen等［15］利用半定量RT-PCR技术对圆环病毒感染猪不同组织中S100A12基因进行检测时发现其増量表达。另外，Chen等［16］还利用Affymetrix基因芯片技术从感染副猪嗜血杆菌猪的脾脏中检测到了大量与炎症有关的高表达基因，其中就有S100A12基因（上调高达16.6倍）。Buhimschi等［17］运用蛋白质组技术对羊水的研究表明，钙粒蛋白C（S100A12）在内的4个生物分子可用于检测子宫内感染炎症的状态。Wathes等［18］研究证实，奶牛在产后2周内，子宫中S100A12、S100A8、S100A9等抗性基因明显上调。有学者首次通过SELDL-TOF质谱技术证实了S100A12和S100A8在怀孕和未孕妇女子宫颈中的存在，并推测生物标记的S100A8和S100A12是子宫颈阴道分泌物的组成部分，参与机体的防御系统，很可能对上行性感染提供持久保护［19，20］。杨永新等［21］研究发现钙粒蛋白C类似物在临床型乳房炎奶牛乳腺组织中表达量增加，据此推测，钙粒蛋白C类似物也具有活化吞噬细胞迁移到组织炎症位点的作用。Buitenhuis等［22］对2头奶牛乳腺人工感染大肠杆菌24 h后基因表达分析得知，相对于健康奶牛乳腺组织，S100A2、S100A8、S100A9和S100A12 4种基因重复上调。雍康［23］、曹随忠等［24］分别应用RT-PCR检测发现S100A12基因在奶牛、牦牛乳腺和生殖系统（卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道）上皮组织中均有表达，推测其在抵御奶牛、牦牛乳腺和生殖系统感染中可能发挥一定的作用。

6S100A12重组蛋白的抗菌活性

S100A12基因在中性粒细胞内表达丰富，分泌后可结合外源抗原，有利于巨噬细胞系统对抗原的清除，在先天免疫过程中发挥着重要作用，具有上调内皮细胞黏附分子、活化炎性细胞、趋化特性和抗菌活性等功能［1］。有研究表明，S100A12蛋白具有抗菌和抗寄生虫作用［25］。由S100A12蛋白15 C-末端氨基酸组成的抗菌肽在锌离子存在的情况下主要有抗革兰氏阴性菌的作用［26］。Lutzow等［25］用肉汤微稀释药敏试验检测得知重组牛S100A12（rS100A12）有抑制大肠杆菌生长的能力，在0.025 mg/mL时抗菌活性最大。但在相同条件下，rS100A12在任何浓度时对金黄色葡萄球菌（ATCC25923）生长抑制都不明显。雍康［23］将S100A12表达纯化后所得到的蛋白，对雅安地区奶牛乳房炎中分离到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抗菌时发现，在0.025 mg/mL时对大肠杆菌没有抑制作用，但随着浓度的增加，抑菌作用逐渐增强，在0.500 mg/mL时作用最强。此外还发现rS100A12在稀释的浓度范围（0.05~0.50 mg/mL）内对金黄色葡萄球菌没有抑菌作用，这点与Lutzow等［25］的报道一致。研究报道， S100A7和S100A15也具有抗菌活性［27，28］。奶牛S100A12可能通过募集中性粒细胞来扩大炎症反应，这种蛋白在抵御乳房炎方面起着重要的作用，因而可以作为一种治疗和预防乳房炎的新型蛋白药物来开发利用。

7展望

Lutzow等［25］、Mitterhuemer等［29］、Lippolis等［30］、Buitenhuis等［22］、Smolenski等［31］、曹随忠等［32］、杨永新等［21］、周雷［33］用不同的方法证实了S100A12基因在患乳房炎奶牛的血液、乳腺、乳汁中增量表达，初步断定可以作为乳房炎早期诊断的一个敏感指标，另外还预测S100A12可能与乳房炎的抗性有关，可以作为奶牛抗性育种的候选因子。目前，对S100A12基因的分子结构和蛋白功能的研究还不深入。此外，S100A12的抗菌机理仍然模糊不清，还需要进一步研究证实。

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［１９］ ＢＵＨＩＭＳＣＨＩ Ｉ Ａ， ＢＵＨＩＭＳＣＨＩ Ｃ Ｓ， ＷＥＩＮＥＲ Ｃ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｂｕｔ ｎｏｔ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ ｆｏｒｍ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００５，１２（７）：８３７－８４４．

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［２８］ ＢＵＣＨＡＵ Ａ Ｓ， ＨＡＳＳＡＮ Ｍ， ＫＵＫＯＶＡ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｓ１００Ａ１５， ａｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｉｎ： ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４［Ｊ］． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００７，１２７（11）：２５９６-２６０４．

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［３１］ ＳＭＯＬＥＮＳＫＩ Ｇ，ＨＡＩＮＥＳ Ｓ，ＫＷＡＮ Ｆ Ｙ， ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］． Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，２００７，６（１）：２０７－２１５．

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