啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近核小体的定位

吴亚坤+杜志强+王建英

摘要：以微球菌核酸酶法分离的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）染色体单核小体DNA为模板进行PCR，根据不同靶序列PCR产物拷贝数的不同定位核小体位置。结果表明，啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近核小体位置大约在39107位到39269位、39318位到39470位及39540位到39694位之间，理论计算结果与试验结果基本一致。

关键词：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；核小体；定位；Ⅲ号染色体；自主复制序列305

中图分类号：Q34；Q949.326.1文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）08－1928-02

Location of Nucleosome around ARS305 on Chromosome III of Saccharomyces cerevisiae

WU Ya-kun，DU Zhi-qiang，WANG Jian-ying

（The Institute of Bioengineering and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，Inner Mongolia，China）

Abstract: Using the variation pattern of ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ of ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ was determined ｗｈｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｏｎｏ－ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ＤＮＡ ｏｆ Sａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ was used ａｓ ｔｈｅ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ． The results ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were ｔｈｒｅｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ａｒｏｕｎｄ ＡＲＳ３０５ of chromosome Ⅲ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ３９１０７－ ３９２６９ ｂｐ， ３９３１８－３９４７０ ｂｐ， ａｎｄ ３９５４０－ ３９６９４ ｂｐ． Cｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ； location； ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ； ＡＲＳ３０５

真核生物的染色质以组蛋白八聚体和紧密缠绕其上147 bp的DNA片段为基本组成结构单元，由于核小体在DNA分子上的可移动性，相邻核小体之间的自由DNA片段长度从10 bp至100 bp不等［1］。在研究啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA分子复制过程中，发现许多具有自主复制活性的序列。试验研究表明，在自主复制序列（Autonomous replicating sequence，ARS）附近通常为核小体缺乏区域，而啤酒酵母Ⅲ号染色体具有强复制起始活性的ARS305及其附近区域却有相对稳定的核小体占据信号［2］。本研究从理论预测和试验验证两方面来研究ARS305附近的核小体占据情况，为后续研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

啤酒酵母由内蒙古科技大学生物工程与技术研究所分子生物学实验室低温保存。

1.2方法

1.2.1引物设计从SGD网站获取啤酒酵母染色体ⅢARS305的基因序列（39159-39706），并依前后延伸后序列（39032-39761）设计15对PCR引物。

1.2.2单核小体DNA提取①摇菌。挑取单菌落接种于2 mL YPD培养基中，30 ℃、200 r/min过夜振荡培养。②扩大培养。取过夜培养物按1∶50（V/V）扩大培养至OD600 nm为0.9。③收集菌体。加入2%的甲醛交联细胞作用30 min，然后用125 mmol/L的甘氨酸使反应猝熄， 4 ℃、4 000 r/min离心10 min收集细胞，并用20 mL 0.01 mol/L的PBS缓冲液清洗菌体1次。④原生质体提取。将菌体重悬于6 mL A液（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、1 mol/L D-山梨醇、10 mmol/L β-巯基乙醇）中，加入终浓度为0.25 mg/mL的酵母裂解酶裂解细胞［3］，4 ℃ 4 000 r/min离心10 min收集细胞后，重悬于2 mL B液（1 mol/L D-山梨醇、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、0.075% Nonidet P40、1 mmol/L β-巯基乙醇和500 μmol/L亚精胺）中。⑤单核小体提取。将上述原生质体溶液分装为每份200 μL，用微球菌核酸酶充分消化后，加入新配制的C液（5% SDS、50 mmol/L EDTA ）终止反应。然后用蛋白酶K法提取DNA，琼脂糖凝胶电泳切胶回收单核小体DNA混合物。

1.2.3PCR定位核小体以单核小体DNA混合物为模板，用15对引物进行PCR扩增，扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，试验结果同Kaplan等［4］的试验数据和理论预测结果［5］对比。

2结果与分析

2.1单核小体DNA提取结果

啤酒酵母菌染色质用微球菌核酸酶处理后，琼脂糖凝胶电泳显示单核小体DNA中含有少量全基因组DNA（图1），切胶回收单核小体DNA混合物（图2）。

2.2PCR扩增定位核小体结果

以单核小体DNA混合物为模板，用15对引物进行PCR扩增，结果如图3所示。由图3可以看出，泳道2、3、4、7、8、9、12、13、14电泳条带明显，可推测引物P2/P2和P4/P4之间，P7/P7和P9/P9之间以及P12/P12和P14/P14之间对应的区域可能被核小体占据，对应于Ⅲ号染色体上的碱基位置为39107位到39269位以及39318位到39470位和39540位到39694位。Kaplan等［4］试验结果表明，在39089（67）位到39258（227）位之间以及39350（319）位到39518（487）位之间和39598（567）位到39750（719）位之间可能存在核小体。

本研究中理论预测结果为在39096（65）位到39296（231）位之间以及39323（292）位到39481（456）位和39580（549）位到39744（713）位之间可能存在核小体。试验实际中检测出的核小体与理论预测及Kaplan等［4］试验结果基本一致。

3小结与讨论

核小体定位技术起源于20世纪80年代，随着基因芯片技术的发展而不断地完善。近年来，随着计算机技术在生物学的广泛应用，利用计算机编程，通过全基因组测序对一维碱基序列的分子结构特性分析，从而从理论上预测核小体位置的方法得到了快速的发展，已经逐渐形成了一套芯片检测-理论预测-试验验证的成熟试验体系［6-8］，为研究染色质结构特性与生物遗传信息传递之间的耦联关系开辟了道路。本试验研究了啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近的核小体定位情况，进一步确定了ARS305作为具有强起始活性的自主复制区域的特殊性。

参考文献:

［1］LEE W， TILLO D， BRAY N， et al. A high-resolution atlas of nucleosome occupancy in yeast［J］. Nature Genetics，2007，39（１０）： １２３５－１２４４．

［２］ＮＥＷＬＯＮ Ｃ Ｓ， ＣＯＬＬＩＮＳ Ｉ， ＤＥＲＳＨＯＷＩＴＺ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ⅲ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ［Ｊ］． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ， １９９３，１８（５）：４１５－４２３．

［３］陈文辉． 对于核小体定位检测方法的比较研究［Ｊ］． 江西科学， ２０１２，３０（１）：５０－５２．

［４］ＫＡＰＬＡＮ Ｎ， ＭＯＯＲＥ Ｉ Ｋ， ＦＯＮＤＵＦＥ－ＭＩＴＴＥＮＤＯＲＦ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５８（７２３６）：３６２－３６６．

［５］ＷＡＮＧ Ｊ Ｙ， ＷＡＮＧ Ｊ， ＬＩＵ Ｇ． Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ： Ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］． Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ，２０１２，２０（７）：８８９－９０２．

［６］ＣＨＡＮＧ Ｆ， ＴＨＥＩＳ Ｊ Ｆ， ＭＩＬＬＥＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＲＳ３１８ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＷＴＷ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１６）：５０７１－５０８１．

［７］ＰＯＬＯＵＭＩＥＮＫＯ Ａ， ＤＥＲＳＨＯＷＩＴＺ Ａ， ＤＥ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２００１，１２（１１）：３３１７－３３２７．

［８］肖建平，丰继华，卢英，等． 基于核小体位置预测的酵母进化印迹研究［Ｊ］． 生物信息学， ２０１３，１１（２）：１５０－１５２．

3小结与讨论

核小体定位技术起源于20世纪80年代，随着基因芯片技术的发展而不断地完善。近年来，随着计算机技术在生物学的广泛应用，利用计算机编程，通过全基因组测序对一维碱基序列的分子结构特性分析，从而从理论上预测核小体位置的方法得到了快速的发展，已经逐渐形成了一套芯片检测-理论预测-试验验证的成熟试验体系［6-8］，为研究染色质结构特性与生物遗传信息传递之间的耦联关系开辟了道路。本试验研究了啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近的核小体定位情况，进一步确定了ARS305作为具有强起始活性的自主复制区域的特殊性。

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［６］ＣＨＡＮＧ Ｆ， ＴＨＥＩＳ Ｊ Ｆ， ＭＩＬＬＥＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＲＳ３１８ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＷＴＷ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１６）：５０７１－５０８１．

［７］ＰＯＬＯＵＭＩＥＮＫＯ Ａ， ＤＥＲＳＨＯＷＩＴＺ Ａ， ＤＥ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２００１，１２（１１）：３３１７－３３２７．

［８］肖建平，丰继华，卢英，等． 基于核小体位置预测的酵母进化印迹研究［Ｊ］． 生物信息学， ２０１３，１１（２）：１５０－１５２．

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核小体定位技术起源于20世纪80年代，随着基因芯片技术的发展而不断地完善。近年来，随着计算机技术在生物学的广泛应用，利用计算机编程，通过全基因组测序对一维碱基序列的分子结构特性分析，从而从理论上预测核小体位置的方法得到了快速的发展，已经逐渐形成了一套芯片检测-理论预测-试验验证的成熟试验体系［6-8］，为研究染色质结构特性与生物遗传信息传递之间的耦联关系开辟了道路。本试验研究了啤酒酵母Ⅲ号染色体ARS305附近的核小体定位情况，进一步确定了ARS305作为具有强起始活性的自主复制区域的特殊性。

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［６］ＣＨＡＮＧ Ｆ， ＴＨＥＩＳ Ｊ Ｆ， ＭＩＬＬＥＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＲＳ３１８ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＷＴＷ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１６）：５０７１－５０８１．

［７］ＰＯＬＯＵＭＩＥＮＫＯ Ａ， ＤＥＲＳＨＯＷＩＴＺ Ａ， ＤＥ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２００１，１２（１１）：３３１７－３３２７．

［８］肖建平，丰继华，卢英，等． 基于核小体位置预测的酵母进化印迹研究［Ｊ］． 生物信息学， ２０１３，１１（２）：１５０－１５２．