母体肢体缺血预处理对宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元凋亡的影响*

吴希珠， 郑晓春， 陈小琳， 陈江湖， 李荣钢， 郑官林， 卢 欢

(1福建医科大学省立临床学院, 2福建省妇幼保健院麻醉科, 3福建省立医院麻醉科，福建 福州 350001)

胎儿宫内窘迫常需要尽快结束妊娠来改善新生儿氧合，其缺氧/复氧过程存在缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤，这也是新生儿缺氧缺血性脑病的主要病因。肢体缺血预处理(limb ischemia preconditioning，LIP)可通过机体内源性机制减轻远隔脏器如心、脑、肺等的缺氧/复氧损伤[1-2]。本研究在胎儿宫内窘迫后，对孕鼠(母体)行LIP预处理，以胎鼠(子体)为研究目标，观察母体LIP能否减轻宫内窘迫胎鼠娩出复氧后的中枢神经系统损伤。因凋亡相关Bcl-2家族成员通过线粒体途径参与了细胞凋亡的调控，本实验定性并定量研究了海马CA1区促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，以期为临床缺氧缺血性脑病的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 动物

清洁级成年SD大鼠16只，其中雌性12只，雄性4只，体重250～280 g，由福建医科大学实验动物中心提供[实验动物许可证号：SYXK(闽)2012-0002]。按雌3/雄1于前1 d晚合笼，次日晨8点阴道涂片检查法确定交配后即可确定为孕 1 d，孕19 d时进行实验。

2 模型构建

2.1胎鼠宫内窘迫(fetal distress，FD)模型构建 取孕19 d大鼠麻醉后下腹正中切开，暴露宫角，以无损伤小动脉夹于近子宫处钳夹双侧子宫动静脉和卵巢动静脉，阻断子宫胎盘血供致胎鼠宫内窘迫，15 min后松开动脉夹，将子宫还纳入腹腔, 逐层缝合。

2.2LIP模型构建 以止血带法在母体右侧腹股沟处同侧阻断下肢血流(脉搏氧饱和度监测)，阻断/开放各5 min，循环3次进行母体LIP。

3 实验分组

孕鼠按随机数字表法分成4组。空白对照(sham,S)组：仅暴露通向子宫和卵巢的动静脉但不阻断；LIP组：于母鼠右下肢实施LIP，余同S组；FD组：阻断子宫和卵巢的动静脉15 min后松开；LIP +FD组：阻断通向子宫和卵巢的动静脉的同时，行母鼠右下肢LIP。

4 取材及标本处理

取材对象为胎鼠。孕鼠(母体)均多胎妊娠，实验后48 h剖宫产，每只孕鼠随机取活胎鼠4只，每组12只，均断头取全脑。每组取6只胎鼠视交叉后1 mm和4 mm处冠状面切开，取中间块固定、脱水、浸蜡、包埋后连续切片，片厚3 μm，取相邻切片分别进行HE染色、TUNEL法凋亡细胞原位染色以及Bcl-2、Bax的免疫组化原位染色。每组另取6只胎鼠新鲜的海马组织，Western blotting法检测Bcl-2和Bax蛋白水平。

5 主要方法

5.1CA1区神经元的形态学观察 HE染色，光镜(×400)下观察。

5.2CA1区凋亡神经元的检测(TUNEL法) TUNEL凋亡试剂盒购自罗氏公司，参照试剂盒说明操作。光镜(×400)下观察胎鼠海马CA1区神经元，选取5个不同视野，分辨TUNEL阳性细胞, 分别计算凋亡指数：阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%，取平均值。

5.3Bcl-2、Bax蛋白表达的免疫组化法检测 试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按试剂盒说明操作。在光镜(×400)下观察胎鼠海马CA1神经元。

5.4Western blotting 检测Bcl-2和Bax的蛋白表达 Ⅰ抗、Ⅱ抗购自北京中山金桥生物技术有限公司。在12%SDS-PAGE凝胶吸取待测样品30 μg电泳，60 V积层胶30 min再100 V电泳分离蛋白。采用Trans-Blot转印仪常规将蛋白转印至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭后加入抗体(1∶300抗鼠Bcl-2或Bax)孵育1 h，过氧化物酶标记检测抗原抗体复合物。自动电泳凝胶成像分析仪上分析结果。

6 统计学处理

各组凋亡细胞、凋亡指数均进行正态性检验，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析，方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用Dunnett’s检验，以P<0.05为差异有统计学意义。数据均用SPSS 17.0 统计学软件处理。

结 果

1 HE染色结果

各组均可见海马完整的横切面结构，S组和LIP组细胞排列紧密，胞核大而圆，可见核仁；FD组和LIP+FD组海马CA1区神经元排列较稀疏，部分细胞胞体缩小,见图1。

Figure 1. Effects of maternal limb ischemic preconditioning (LIP) on CA1 hippocampal neurons in fetal rats (HE staining, ×400).S：sham; FD: fetal distress.

2 TUNEL染色结果

各组均见凋亡的神经元细胞，细胞核呈深棕色，染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体,见图2。与S组比较，FD组胎鼠海马CA1区神经元凋亡指数增加(P<0.01)，LIP组胎鼠海马CA1区神经元凋亡指数无明显改变(P>0.05)，LIP+FD组凋亡指数增加(P<0.05)；与FD组比较，LIP+FD组细胞凋亡指数降低(P<0.05)，见表1。

Figure 2. The apoptotic hippocampal neurons in fetal rats detected by TUNEL assay (×400).S: sham;LIP:limb ischemic preconditioning;FD: fetal distress.

表1 母体LIP对胎鼠海马神经元凋亡的影响

3 免疫组化法染色结果

在Bcl-2和Bax的免疫组化切片中，各组均可见胞浆阳性染色，呈棕褐色,见图3、4。

4 Western blotting 检测Bcl-2和Bax蛋白的表达

与S组比较，FD组和LIP+FD组的Bcl-2和Bax蛋白表达增加，Bcl-2/Bax的比值降低，而LIP组的Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax的比值无明显改变(P>0.05)；与FD组比较，LIP+FD组Bcl-2/Bax蛋白表达的比值增加,见图5。

Figure 3. The protein expression of Bcl-2 in hippocampal neurons of fetal rats detected by immunohistochemical method (DAB staining，×400).

Figure 4. The protein expression of Bax in hippocampal neurons of fetal rats detected by immunohistochemical method (DAB staining, ×400).

Figure 5. The protein expression of Bcl-2 and Bax in hippocampal neurons of fetal rats determined by Western blotting. β-actin was used as loading control. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs S; #P<0.05 vs FD.

讨 论

本研究通过阻断孕鼠双侧子宫和卵巢的动静脉成功复制了胎鼠宫内窘迫模型，胎鼠海马CA1区出现了明显的凋亡现象；同时在宫内窘迫模型的基础上在母体实施LIP，胎鼠海马神经元的凋亡减轻，Bcl-2蛋白的表达上调。文献报道，全身性的低氧预处理可缓解缺血再灌注后新生鼠脑皮质和海马组织的丢失，改善脑的微循环[3]。相对于全身性的缺氧预处理，在本实验中，我们采用母体的LIP，但仍然观察到了LIP的脑保护作用，且与抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达上调相关。

LIP通过四肢等更能耐受缺血的脏器进行缺氧预处理可以减轻远隔脏器如脑、心脏、肝等的再灌注损伤，其对脏器保护作用的可行性和有效性，在临床试验中不断得到肯定[1]。Btker等[4]将LIP应用于临床心梗病人经皮冠脉支架植入术的研究，发现心肌存活率增加。胎儿宫内窘迫/剖宫娩出可类比心肌梗塞后/支架植入再通，同样存在缺血/再灌注损伤的病理过程。LIP能激发机体产生内源性保护机制，其中循环和/或神经系统是器官间信号传导通路。在体的胎鼠与母体通过胎盘屏障和血液系统存在物质交换。孕后期胎盘屏障通透性增加，研究报道分子量为169的谷氨酸钠不但可通过孕鼠的胎盘屏障还能透过胎鼠的血脑屏障，而一氧化氮(nitric oxide,NO)分子量仅30，还具有高脂溶性，可快速透过生物膜扩散。在LIP远隔脏器保护效应的研究中，较多文献肯定了NO在快速保护相中的第一信使角色，据此推测在孕鼠LIP对胎鼠海马神经元的保护机制中可能扮演重要角色。低浓度的NO能通过促进抗凋亡蛋白Bcl-2和热休克蛋白70的表达以及抑制胱天蛋白酶家族的作用来抑制细胞的凋亡[5]。而外源性Bcl-2反义寡脱氧核苷酸下调Bcl-2蛋白表达的同时，阻断了脑缺血预处理的脑保护作用[6]。因此本实验中，母体的LIP可能通过产生低浓度的NO透过胎盘屏障促进了胎鼠海马CA1区Bcl-2蛋白表达，从而减轻了宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元的凋亡。

综上所述，本研究在胎鼠急性缺氧期间，在母体实施LIP预处理，信号分子能通过胎盘屏障激发胎儿中枢神经系统的内源性保护机制，减轻了胎鼠复氧后海马神经元的凋亡，其中机制可能与上调了胎鼠海马CA1区抗凋亡蛋白Bcl-2的表达相关，进一步的研究中将对新生鼠的学习记忆能力等行为学深入探讨。

[参 考 文 献]

[1] 王良荣，郑浏璞，蒋柳明，等. 无创性缺血预处理对肢体缺血再灌注性肺换气功能损伤及一氧化氮/内皮素-1失衡的影响[J].中国病理生理杂志，2010, 26(2):322-326.

[2] 陈光献，唐白云，梁孟亚，等. 远程预处理通过下调钙网蛋白高表达减轻在体大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤[J]. 中国病理生理杂志，2009, 25(8):1469-1473.

[3] Lin WY, Chang YC, Ho CJ, et al. Ischemic preconditioning reduces neurovascular damage after hypoxia-ischemia via the cellular inhibitor of apoptosis 1 in neonatal brain[J]. Stroke, 2013, 44(1):162-169.

[5] Chung HT, Pae HO, Choi BM, et al. Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282(5):1075-1079.

[6] Shimizu S, Nagayama T, Jin KL, et al.bcl-2 antisense treatment prevents induction of tolerance to focal ischemia in the rat brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2001, 21(3):233-243.